细胞老化介导皮肤衰老的研究进展

刘文杰 姜敏 项蕾红

复旦大学附属华山医院皮肤科上海市皮肤病研究所 200040

衰老（aging）是指机体随年龄增长而出现的生理功能渐进性丧失，细胞老化（cellular senescence）是特指细胞连续分裂后出现的细胞周期停滞及特定表型。二者既有区别又有联系，本文从概念上阐明二者异同，并综述细胞老化在皮肤衰老中的机制和意义。

一、概念

衰老是机体形态退化、功能减退、疾病易感性逐渐增加的过程，易伴发恶性肿瘤、糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病等诸多重大疾病。

细胞老化是细胞逐渐走向衰亡的形式之一，特征如细胞周期阻滞，DNA损伤及染色体变化，衰老相关分泌表型增加等。

关于二者的联系，López-Otín等［1］归纳指出，细胞老化是衰老的9个基本生物学特征之一，更是衰老发生发展的重要机制。换言之，衰老是侧重整体和结局的大概念，细胞老化是侧重机制和过程的小概念，前者为果，后者是因。

二、皮肤衰老

人类皮肤衰老的表现多样，包括皮肤变薄，弹性下降，出现皱纹；附属器萎缩、减少；屏障功能下降，经皮水分丢失增加，皮脂分泌减少，易干燥；色素代谢异常，色素可脱失，亦可沉积；肿瘤倾向，如基底细胞癌等。

从病因学分类，皮肤衰老主要有内源性和外源性两种表型。内源性衰老又称自然衰老，是与年龄直接相关的退行性变，遗传背景、内分泌等不可抗力是其主因［2］。内源性衰老使表皮、真皮和皮下组织均萎缩。基底细胞分裂减少，棘细胞层萎缩，朗格汉斯细胞、黑素细胞减少，使表皮萎缩10%～50%。在真皮，成纤维细胞减少，胶原、弹性纤维等细胞外基质的含量大幅降低，乳头层变平，腺体稀疏，使得真皮萎缩［3］。除此之外，皮下脂肪的更新率及含量亦有下降。外源性衰老是在身体暴露部位，紫外线、吸烟、有毒物质等的外在伤害使皮肤发生衰老［3］。外源性衰老并非单纯在内源性衰老的基础上使得皮肤更加菲薄，而是使表皮角质层局灶增厚，真皮内出现病态成纤维细胞，其产生的异常弹性纤维和胶原纤维不能被及时降解，最终导致皮肤呈现皮革样外观［4-5］。

三、细胞老化

细胞老化指具有复制能力的细胞受到各种刺激（如活性氧簇、DNA损伤、端粒损耗等）后持久性细胞周期停滞［6-7］。1961年，由Hayflick提出此概念，他认为哺乳动物细胞都会有细胞分裂的极限，即复制衰老，亦称为Hayflick极限［8］。

就皮肤而言，细胞老化的主要特征有：①细胞形态学改变，例如变大、变平、空泡化等；②衰老相关β半乳糖苷酶染色阳性；亦有学者认为，苏丹黑B染色（Sudan-Black-B）或者苏丹黑B类似物GL13染色较β半乳糖苷酶染色更优［9-10］；③细胞周期阻滞相关的蛋白表达上调，如p16INK4A、p21Waf-1等［11］；④细胞老化相关的DNA损伤及染色体变化，如DNA损伤反应通路（DNA damage response pathway）激活，出现衰老相关异染色质灶，核纤层蛋白B1丢失［12-13］；⑤产生更多衰老相关分泌表型，如白细胞介素（IL）6、IL-8及基质金属蛋白酶（MMP）等；⑥产生更多衰老相关的微小RNA（microRNA），如miR-34、miR-29家族与真皮衰老相关，miR130、miR181家族与表皮衰老相关［14-16］。

四、细胞老化和皮肤衰老的关系

在不同组织中，介导衰老的具体机制可能并不相同。2013年，López-Otín等［1］在归纳总结衰老的基本特征时，除细胞老化之外，还提到了基因组不稳定性、端粒损耗、表观遗传学改变、蛋白质稳态丧失、对营养的感应失调、线粒体功能障碍、干细胞耗竭和细胞间通讯异常等其余8项机制。

有学者报道，细胞老化并非所有衰老组织的普遍特征。通过对小鼠肝脏进行精细量化分析发现，青年鼠肝脏中老化细胞约8%，老年鼠约17%；皮肤、肺和脾脏亦有类似结果，但心脏、骨骼肌和肾脏中则未见类似改变［17］。一种可能的解释是，在肝脏、皮肤、肺和脾脏中，细胞老化是介导衰老的主要机制之一；而在心脏、骨骼肌和肾脏中，介导衰老可能另有其他机制。进一步研究发现，人类皮肤与小鼠皮肤结果相似，其衰老程度与老化细胞数量存在平行关系。随着皮肤的衰老，真皮及表皮中β半乳糖苷酶和p16INK4A染色阳性的老化细胞数量均显著上升［11，18］。

细胞老化不仅是衰老的基本特征，更是介导皮肤衰老的重要机制。老化细胞丧失了增殖能力，破坏微环境稳定性，妨碍皮肤再生。在小鼠模型中，p16INK4A阳性细胞的聚积确会导致其所在组织的衰退。构建敲减p16INK4A的转基因鼠或者在野生型小鼠中清除p16INK4A阳性的老化细胞均可使小鼠的皮下脂肪增厚，毛发浓密，皮肤更为年轻［19］。另有实验利用特定的肽段靶向阻遏头框转录因子O家族4与p53结合，诱导老化细胞凋亡，也可使早老小鼠毛发变黑、浓密，肾功能改善，寿命延长［20］。类似的，在人不同年龄的离体皮肤三维模型中，上调p16INK4A可使年轻人（30～40岁）表皮衰老菲薄，而在老年人（53～66岁）表皮中下调p16INK4A可使表皮增厚［18］。

五、细胞老化介导皮肤衰老的机制

皮肤细胞老化有多方面的特征和机制，其中细胞老化相关的DNA损伤、细胞周期阻滞蛋白上调、衰老相关分泌表型等方面与皮肤衰老的关系尤为密切。

（一）细胞老化相关的DNA损伤与皮肤衰老：DNA完整性对维持皮肤细胞正常状态十分重要。外界因素如吸烟、紫外线、PM2.5等以及内源性的氧化因子刺激易使细胞内活性氧簇水平升高，进而损伤DNA并使染色体的形态结构发生改变，出现衰老相关的异染色质灶。衰老相关的异染色质灶是常染色质DNA凝集、聚结成为散在、致密、大小不一的异染色质颗粒，其参与了老化过程中细胞周期调控基因的转录沉默，进而在不可逆的细胞周期阻滞中发挥重要作用［1，12］。

DNA损伤（尤其是双链断裂）会激活DNA损伤反应通路来启动修复。首先，损伤信息会被减数分裂重组11（MRE11）复合物（MRE11-RAD50-NBS1复合体）接收；随后上游的毛细血管共济失调突变基因（ATM）被激活，进而激活细胞周期监测点激酶2，导致p53蛋白激活、组蛋白磷酸化。除此之外，ATM亦作用于衰老调控因子可变阅读框，并通过激活DNA损伤反应通路共济失调毛细血管扩张突变基因Rad3相关激酶（ATR）和细胞周期检测点激酶1，使得核因子κB和p53激活并稳定存在。因而作为抑癌基因，p53在大多数肿瘤中表达下降，但在老化的细胞中却上调。亦有研究报道，在皮肤成纤维细胞中，甲基化的m6A RNA在紫外线诱导的DNA损伤中发挥重要作用，当m6A甲基化相关的转甲基样酶3表达被抑制后，细胞的损伤修复急剧减缓。因此，包括上游放大反应信号的激酶ATM、ATR，下游传导信号的激酶细胞周期检测点激酶1、2，以及效应蛋白p53、磷酸化的组蛋白等，这些因子均可作为细胞老化的佐证［11］。皮肤细胞DNA损伤后，会进一步引起细胞周期阻滞，另一方面也会导致基因组不稳定，易罹患年龄相关的皮肤肿瘤，如脂溢性角化病、日光性角化病、基底细胞癌、鳞状细胞癌等。

（二）细胞周期阻滞与皮肤衰老：迄今为止，老化相关的细胞周期阻滞主要涉及两条通路：一条是p19-p53-p21-周期蛋白依赖性激酶（CDK）2，另一条是p16INK4A-CDK4/CDK6。他们均能抑制视网膜母细胞瘤蛋白的磷酸化，非磷酸化状态的视网膜母细胞瘤蛋白可与其下游E2F转录因子结合，使E2F无法激活，阻止细胞由G1进入S期，使细胞周期停滞。有学者认为，p53除衰老之外，还参与细胞凋亡等多种通路，在老化的表皮角质形成细胞中并未高表达；相比而言，p16INK4A对预示细胞老化的特异度更高。当然，衰老的相关通路并不局限于此，部分衰老过程依赖p21Waf-1信号通路的介导，但却不引起p53或者p16INK4A的变化，这也说明细胞老化还存在除p16INK4A和p53之外的其他通路［6-7，13］。

真皮中的成纤维细胞常作为研究皮肤衰老的体外模型。实验表明，离体长波紫外线A处理的成纤维细胞可见明显的细胞周期阻滞，细胞周期阻滞的相关蛋白p16INK4A、p21Waf-1及p53均可见明显上调。角质形成细胞周期阻滞后，出现表皮更新变缓，厚度变薄，经皮水分丢失增加，屏障功能受损等衰老表现；成纤维细胞周期阻滞后，出现真皮成纤维细胞流失，真皮的胶原、弹性纤维等细胞外基质的含量大幅减少［16，21］。

（三）衰老相关分泌表型与皮肤衰老：衰老相关分泌表型是由老化细胞产生的炎性细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶等分泌性蛋白的统称，既是细胞老化的标志，又是导致皮肤衰老的重要机制。在皮肤中，衰老相关分泌表型主要包括MMP，炎性因子IL-1、IL-6以及富含半胱氨酸蛋白61等。老化细胞主要靠DNA损伤反应通路依赖的p16INK4A途径、p21-活性氧簇依赖的p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径以及核因子κB途径等上调衰老相关分泌表型的分泌，并通过自分泌和旁分泌等方式诱导邻近细胞的进一步老化。

1.MMP：主要由老化的成纤维细胞分泌，在外源性和内源性衰老中均会显著增加，是导致皮肤衰老尤其是真皮衰老的重要机制。活性氧簇聚集是老化成纤维细胞产生包括MMP在内的衰老相关分泌表型的重要始动因素之一。活性氧簇通过使蛋白酪氨酸磷酸酶失活，导致受体酪氨酸酶激活，进而使其下游途径MAPK家族（细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶、p38MAPK）活化，活化的MAPK再激活下游转录因子激活蛋白1，导致MMP-1、3、9等的产生［21］。MMP的升高可导致胶原（尤其是Ⅰ型胶原）的丧失，降低成纤维细胞和胶原的联结，使皮肤成纤维细胞外基质丧失，皮肤褶皱增加。

2.富含半胱氨酸蛋白61和IL-1β：富含半胱氨酸蛋白61是真皮成纤维细胞分泌促衰老的重要细胞因子。其可能的机制是富含半胱氨酸蛋白61与整合素结合后使胞内活性氧簇水平上升，活性氧簇再激活核因子κB和MAPK，使IL-1β表达上调，进一步导致MMP增多、Ⅰ型胶原减少。同时，IL-1β作用于老化成纤维细胞，使转化生长因子β受体的表达下调，削弱转化生长因子β/smad信号传导，使胶原代谢紊乱［22-23］。

3.IL-6：广泛认为IL-6与衰老程度呈正相关，但对皮肤却并非完全如此。在真皮中，IL-6阳性成纤维细胞随着年龄增长含量明显上升。IL-6上调MMP导致胶原表达量下降并可使无功能性胶原比例上升。但在皮脂腺中，IL-6阳性细胞数量随着衰老却明显减少［24］。另有实验表明［25］，与年轻鼠相比，年老鼠受损表皮IL-6的下降更明显；在外部给IL-6后，年老鼠的表皮修复效果要比年轻鼠获益更大。这提示，虽然IL-6是一种衰老相关表型，但其仍是一种很重要的炎性因子，因此衰老皮肤与年轻皮肤相比油脂分泌减少、创伤后修复困难。

抑制衰老相关分泌表型的分泌可促进机体健康和延长寿命。目前，部分已知的具有抗衰老作用的药物（如雷帕霉素、二甲双胍、JAK 1/2抑制剂等）可通过不同的信号通路减少相关衰老相关分泌表型的分泌。如雷帕霉素是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂，能诱导细胞自噬，但同时其作用于DNA损伤反应通路中的关键酶ATM以及线粒体中过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子-1β等途径亦可抑制核因子κB，在mRNA和蛋白水平抑制衰老相关分泌表型的产生［26］。需特别指出的是，不同衰老实验模型所产生的衰老相关分泌表型多种多样，自然状态下衰老相关分泌表型如何产生和发挥作用更是纷繁复杂，因此衰老相关分泌表型与衰老的关系及其作用机制尚需更多深入的探索。

六、细胞老化在创伤修复中的作用

尽管细胞老化具有促进机体衰老等诸多不利影响，但在某些特定时期和特定状态下，其亦能发挥积极作用，如维持胚胎正常发育、抑制肿瘤、组织再生和促进胰腺β细胞分泌胰岛素等［27-29］。就皮肤而言，细胞老化对于创伤皮肤修复具有重要的促进作用。创伤早期，创伤部位富含半胱氨酸蛋白61含量明显升高，诱导创伤周围成纤维细胞和角质形成细胞产生活性氧簇，使细胞老化，这些老化细胞通过分泌血小板来源生长因子AA等，诱导成肌纤维细胞的分化并且预防组织机化，促进创伤修复［23，30］。

七、结语

衰老是年龄相关的机体退行性变，每一个个体均无法避免，无法中止和逆转，抗衰老是千百年来人们的心愿。现有的研究提示，细胞老化既是衰老的重要标志，也是衰老发生发展的重要机制，靶向清除老化细胞是一种很有前景的年轻化策略。但衰老的机制复杂，有关细胞老化的确切机制、对皮肤生理功能的全面影响还需进行更深入的研究，以期今后能采取更有效的预防措施，提升人们的保护意识，研发新的防御方法，促进皮肤健康。