黄芪多糖在水产动物疾病防控中的应用

李春静，张 杰，祝雅晨，孔祥会

( 河南师范大学 水产学院，河南 新乡 453007 )

随着水产养殖技术的提高，集约化养殖规模逐渐扩大，水产养殖种类不断增多，养殖水环境也进一步恶化，发病率的明显升高给水产养殖业造成巨大经济损失。目前，在水产养殖中激素、抗生素、化学合成药物等应用普遍。但由于渔药的不合理使用，尤其是抗生素类药物的滥用，导致病原微生物产生耐药性，养殖鱼类免疫力降低和环境受到污染；此外，药物残留使水产品的品质下降。因此，研发和应用低毒、高效、低残留的中草药是水产动物疾病防控的重要选择[1]。

天然中草药具有独特的抗微生物和寄生虫的抗菌驱虫作用，无有害残留及不易使水产品产生耐药性等，毒副作用小。中草药免疫活性物质主要分为多糖、苷类、生物碱、有机酸、挥发性油等[2]。研究表明，将一些中草药单独或按比例混合使用可以促进鱼体生长发育；降低饲料系数，提高营养物质的利用率[3]；改善肠道菌群的组成[4]，增强机体免疫力[5]。但是，中草药成分复杂，直接使用并不能确定单一的有效成分，科研人员转而研究中草药的活性成分，探讨中草药主效成分及其作用机理。

黄芪(Astragalusmembranaceus)作为一种促生长和提高水产品品质的水产饲料添加剂，其作用及相关机理逐渐被人们揭示，但仍有许多方面值得深入研究。研究证明，在饲料中添加黄芪多糖(APS)可不同程度地提高动物超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、溶菌酶等酶活力[6-7]，且其活性与给药剂量呈正相关；黄芪多糖可以提高动物的抗病能力[8-9]，但是对动物免疫的增强作用与黄芪多糖添加水平之间并非线性关系；黄芪多糖能抑制维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)引起的鲫鱼(Carassiusauratus)细胞凋亡[10]。这些研究结果从个体以及细胞层面证明了黄芪多糖可以提高动物的特异性和非特异免疫及抗病性。笔者总结近年来黄芪多糖在水产动物抗病中的研究应用效果，以作为今后开展黄芪多糖研究和防病应用的理论依据。

1 黄芪多糖

1.1 黄芪多糖的特征

黄芪毒副作用小，价格低，不易产生抗药性，作为一种补益中草药添加剂迄今已应用逾2000年。1943年多糖作为药物开始使用，1981年黄芪多糖首次被提取分离，其分子式为C10H7ClN2O2S[11]。黄芪多糖是黄芪的主要活性成分之一，是黄芪干燥的根经提取、浓缩和纯化而成的水溶性多糖，具有抗病毒、抗疲劳、抗衰老、抗菌等功能[12-14]，能综合性地提高机体免疫力，促进抗体产生，延长抗体作用时间，并能诱生干扰素，起到抗病毒的作用[15]。

多糖化学结构是其生物活性的物质基础，单糖的组成对多糖活性的影响远远小于糖苷键和单糖连接方式[16]。研究发现，组成黄芪多糖的单糖为鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖；在构成黄芪多糖的单糖中，甘露糖是主要成分，其次是葡萄糖[17]。黄芪多糖包括3个亚型: APSⅠ、APSⅡ和APSⅢ。APSⅠ为由D-葡萄糖、D-半乳糖及L-阿拉伯糖构成的杂多糖，其平均相对分子质量为36.3 ku；APSⅡ和APSⅢ均为葡聚糖，多以α-(1→4) 键连接，少数以α-(1→6) 键链接[18]。刘星堦等[19]从膜荚黄芪中获得黄芪多糖，由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，摩尔比为葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖=1∶0.95∶0.70。邹一愚等[20]采用乙醇沉淀法将分级得到两组分APSⅠ和APSⅡ，两者之比为0.31∶0.69；APSⅡ中葡萄糖含量明显低于APSⅠ，且APSⅠ中不含半乳糖和阿拉伯糖，但木糖含量很高。说明黄芪多糖中大分子量部位含有大量戊糖，而小分子量部位则以葡萄糖和半乳糖为主。以上研究证实，黄芪多糖的单糖组成和侧链结构由于提取的品种和工艺不同差异很大。

1.2 黄芪多糖提取方法

黄芪多糖可通过多种方式从黄芪中提取，主要有水提取法、碱醇提取法、酶解法、超声波浸提法、微波提取法、组织破碎提取法、超高压提取法和超滤法。丁利君等[21]分别比较了水浴浸提法、超声波浸提法和微波浸提法等多种方法提取黄芪多糖的效果，发现水浴浸提法提取率最高。用微波萃取技术从蒙古黄芪干燥根中萃取黄芪多糖[22]，测得的相对分子量为11 ku，纯度达97.16%；用红外光谱、13C核磁共振和1H核磁共振技术确定试验所得黄芪多糖主链由葡萄糖以α-型糖苷键连接而成。刘星堦等[19]通过水提法再经柱层析洗脱获得黄芪多糖，初步纯化得粗多糖，再进一步纯化得平均分子质量为37.5 ku的白色粉末状黄芪多糖。目前黄芪多糖的提取主要还是以传统的水提法和酶解法为主，但有研究表明，将传统方法与超滤等现代化工艺相结合，可提高黄芪多糖的纯度以及提取率。

1.3 黄芪多糖的安全性

黄芪多糖急性和亚慢毒性试验结束时，小鼠行为及各组织(心脏、肺、肝脏、肾脏)均正常，未发现任何毒副反应[23]，表明黄芪多糖对动物是安全的。吴旋等[24]急性毒性试验表明，黄芪多糖对金丝鱼(Tanichthrsaltbonubes)的96 h 半数致死质量浓度高达2394.89 mg/L，表明较高剂量使用黄芪多糖也是安全的。试验证明，以推荐剂量(日添加10 mg/kg)、3倍推荐剂量、5倍推荐剂量连续21 d投喂草鱼(Ctenopharyngodonidella)，分阶段采取试验草鱼全血及血清进行临床病理学检测和组织病理切片。结果表明，黄芪多糖喂养的草鱼未见细胞及组织上的异常。以推荐剂量投喂黄芪多糖养殖水产动物安全可靠，即使达到5倍的推荐剂量时，也没有安全性问题[25]。由此可见，黄芪多糖可以作为一种安全、有效的免疫增强剂应用于水产养殖业，并且对人体无毒害。

2 黄芪多糖的抗病作用机理

2.1 黄芪多糖可促进免疫器官的发育

与哺乳动物免疫器官组成不同，鱼类没有骨髓和淋巴结，头肾为主要的造血器官。鱼类免疫器官与组织主要指肾脏、脾脏、胸腺以及消化道淋巴组织与小淋巴细胞等；黏膜淋巴组织也是其免疫系统的重要组成部分[26]。

黄芪多糖能够促进动物胸腺、骨髓、脾脏的质量增加和发育，而免疫器官的质量和发育会直接影响机体免疫力[27]。林旋等[28]在基础饲料中添加不同剂量黄芪多糖，结果发现，黄芪多糖可促进鱼体免疫器官的发育和成熟，从而提高鱼体免疫力；黄芪多糖作用效果随着添加量的升高而增强。在鲤鱼(Cyprinuscarpio)的研究中也有相似的结果，饲料中添加1%的黄芪多糖，能够明显提高鲤鱼胸腺、头肾和脾脏的质量，增强鲤鱼免疫机能[29]。黄芪多糖能有效增加免疫器官质量，促进部分脏器的发育，增强机体的免疫功能；大量研究数据也表明，黄芪多糖可提高水产动物的质量增加率以及饲料的利用率。

2.2 黄芪多糖可促进细胞因子表达及分泌

细胞因子是一类由免疫细胞产生，能在细胞间传递信息、具有免疫调节功能的蛋白质或小分子多肽。它通过结合细胞表面相应的细胞因子受体而发挥生物学作用。近年来，鱼体内检出和推断存在的细胞因子多达几十种，研究较为深入的两类鱼类细胞因子是IL-1β[30-31]和TNF-α[32]，前者作为一种多效促炎细胞因子，在炎症过程中起着重要作用，可以通过诱导淋巴细胞、相关组织细胞、血管内皮细胞和炎症反应效应细胞的生长和发育，促进细胞调控免疫；TNF-α可增强吞噬作用、趋化作用以及溶菌酶合成等多种细胞反应。鲤鱼注射不同剂量黄芪多糖后，检测其细胞因子和免疫相关基因在不同组织中的表达。结果发现，黄芪多糖对IL-1β在鳃和脾脏的表达没有显著提升，但高剂量黄芪多糖可促进TNF-α在鳃和脾脏中的转录表达，低剂量和中等剂量的黄芪多糖分别可以促进C型溶菌酶在鳃和脾脏中的表达；并且头肾中IL-1β和TNF-αmRNA表达量随黄芪多糖剂量的增加而升高[33]。腹腔注射黄芪多糖，可诱导C型溶菌酶在吉富罗非鱼(OreochromisniloticusGIFT)鳃、头肾、肝脏和脾脏等组织中的表达[34]。摄食添加黄芪多糖饲料的鲫鱼，其肝脏、脾脏、肾脏中总一氧化氮合酶、一氧化氮、诱导性一氧化氮合成酶含量明显高于未添加组[29]。这些结果表明，虽然黄芪多糖的抗病作用受多因素相互调节的，但是促进细胞因子的表达进而提高鱼类免疫仍作为其抗病机能的重要部分。

2.3 黄芪多糖可提高非特异性免疫能力

非特异性免疫是动物在进化过程中所形成的抵御抗原微生物侵入及杀灭、吞噬病原微生物的免疫能力，具有先天性和可遗传性。

2.3.1 吞噬作用

巨噬细胞是鱼类最重要的免疫活性细胞之一，其在识别、吞噬外来病原微生物，处理和呈递抗原，激活淋巴细胞，启动特异性免疫应答以及分泌免疫因子等方面发挥重要作用[35-37]。黄芪多糖作用于离体培养的鲤鱼头肾巨噬细胞，可显著提高巨噬细胞的氧、氮呼吸暴发活性[38]。黄芪水提取液单独使用时能刺激鲤鱼头肾中巨噬细胞增殖，却不能刺激巨噬细胞的氧、氮暴发活性[39]。白东清等[40]发现，黄芪多糖能够有效地提高黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)吞噬细胞的吞噬活性，并且随黄芪多糖添加水平的添加而升高，用迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)攻毒后死亡率相比对照组显著降低。

白细胞具有趋化性，当病原体侵入或自身组织坏死时，通过胞吞作用吞噬异物，其吞噬能力是鱼类非特异性免疫功能的重要指标之一[41]。在罗非鱼[28]基础日粮中添加100、500、1000 mg/kg和1500 mg/kg黄芪多糖，试验结果表明，黄芪多糖可以不同程度地提高罗非鱼血液中白细胞的吞噬能力，第40 d时，1500 mg/kg黄芪多糖对白细胞的吞噬能力提高至112%。Ardó等[42]研究结果同样表明，黄芪多糖可明显提高尼罗罗非鱼(O.niloticus)白细胞吞噬活性。相似的结果在大鳞副泥鳅(Paramisgurnusdabryanus)[43]中也有发现。用不同剂量(100、150、200、250 mg/kg)的黄芪多糖投喂杂交鲌，30 d后250 mg/kg组鲌的白细胞吞噬活性提高最为显著，并且用嗜水气单胞菌(A.hydrophila)攻毒发现，黄芪多糖能提高杂交鲌的免疫保护率[44]。以上研究结果与哺乳动物中的结果相似[45]，表明黄芪多糖可通过识别巨噬细胞表面受体，调节巨噬细胞活性，影响巨噬细胞和细胞因子的分泌，增强机体的免疫功能。

2.3.2 抗氧化作用

超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽在细胞自由基损伤中起着关键作用[46]。黄芪多糖可以提高超氧化物歧化酶活性及总抗氧化能力[47]，对OH-和O2-自由基有清除作用，且在一定浓度范围内，与黄芪多糖剂量呈正相关性[21]。Zahran等[48]发现，黄芪多糖可提高尼罗罗非鱼超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、溶菌酶活性及丙二醛含量。樊英等[49]也发现，添加3%和5%黄芪多糖微胶囊可以提高仿刺参(Apostichopusjaponicus)体腔液中酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、髓过氧化物酶活性；用灿烂弧菌(Vibriosplendidus)攻毒后对仿刺参的免疫保护率可分别达到66.67%和69.44%。在半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)饲料中添加黄芪多糖时，添加600 mg/kg黄芪多糖能显著提高鳃黏液中溶菌酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性，提高机体的非特异性免疫能力[50]；在中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)[51]中也有相似报道。同时，在齐口裂腹鱼(Schizothoraxprenanti)[3]、黄颡鱼[43]、草鱼[52]、鲫鱼[53]、杂交鳢(Channamaculate♀×C.argus♂)[54]、克氏原螯虾(Procambarusclarkii)[55]、中华鳖(Pelodiscussinensis)[56]、大口黑鲈(Micropterussalmoides)[57]以及凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)[58-59]中均发现有相似的结果。目前关于多糖的抗氧化作用机制主要有两种解释，一种是OH-可以夺取多糖碳氢链上的氢原子结合成水，而多糖碳原子上留下单电子可继续氧化形成过氧自由基，后者可进一步分解；另一种是多糖环上的羟基可与产生OH-等所必需的金属离子络合，从而抑制活性氧自由基的产生[60-61]。无论是哪种机制，黄芪多糖都可通过激活体内多种酶活性，及时清除自由基，减少氧化应激，提高机体免疫力，增强机体抗病能力。

3 黄芪多糖的应用

随着黄芪多糖作用机理的深入研究，其在水产养殖中也得到了广泛应用。中药多糖主要通过注射法、灌注法、浸泡法和饲料投喂法等方式应用于水产养殖，但是由于水产养殖数量庞大，因此一般作为免疫增强剂添加到饲料中改善肠道菌群的组成，提高营养物质的利用率，促进鱼体生长发育，增强鱼体免疫力[62]。目前，水产动物病害仍以细菌性疾病为主，各种水生病原菌作为主要传染性疾病病原，造成了巨大的经济损失；嗜水气单胞菌能引起许多淡水鱼类的细菌性出血病，其传播速度快、发病范围广，是淡水鱼类暴发性传染病最主要的病原菌之一。在日粮中添加不同含量的黄芪多糖，可以提高细菌感染的鲤鱼[63]、黄颡鱼[64]以及大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[65]等的存活率。白斑综合征病毒是对虾养殖中危害最大的一类病毒，可使对虾短时间内大量死亡。凡纳滨对虾注射白斑综合征病毒后，与对照组相比，0.2 g/kg 黄芪多糖显著提高对虾成活率，可见黄芪多糖能增强凡纳滨对虾抵抗白斑综合征病毒的感染能力[66]。同时，周智愚等[67]发现，黄芪多糖能够提高草鱼母本免疫能力并向子代垂直传递，在应对草鱼呼肠孤病毒感染时发挥一定免疫保护作用。研究表明，在饲料中添加黄芪多糖，可以增加罗非鱼肠绒毛的长度[48]，增强其对营养物质的吸收；降低氧化损伤，提高抗氧化能力以及对肝组织保护作用[63]。水产动物疾病防控原则“防治结合，防重于治”，因此要主动发挥黄芪多糖对疾病的预防作用，同时也要加强对疾病治疗作用的研究。

4 总结与展望

中草药可增加不同鱼类和贝类对细菌、病毒和寄生虫的特异性和非特异性免疫能力[68]，在水产动物疾病防控中具有独特优势，已成为控制水产动物疾病发生的重要渔药。中草药黄芪不仅具有抗病和促生长作用，而且无任何毒副作用。黄芪多糖作为一种重要活性成分，可通过激活免疫细胞功能而增强机体免疫力。水产动物中黄芪多糖可促进巨噬细胞和白细胞的吞噬功能，也可促进干扰素的产生，抑制病毒繁殖。但是在水产养殖中使用的黄芪多糖多为粗多糖，多以免疫佐剂或饲料添加剂应用，研究还不够深入。今后，黄芪多糖研究的重点应集中于：(1)利用现代化技术方法，对黄芪多糖进行提取分离，利用先进的研究方法对黄芪多糖结构进行深入研究，为黄芪多糖的开发应用奠定基础；(2)深入研究黄芪多糖作用机理，理解其免疫增强的作用；(3)加强黄芪多糖与其他中草药成分的配伍及其协同作用研究，研发出高效的抗病中草药合剂，以使其更好地应用于水产动物疾病防控，从而减少疾病造成的渔业损失。