驴精液冷冻保存技术研究进展

郝志明，陆树林，杨新军，陆彦名，王愿林，景兆国，沈鸿武

（1.天津农学院动科系，天津 300384；2.甘肃龙麒生物科技股份有限公司，瓜州 736100）

驴的精液冷冻保存技术是在马的精液冷冻保存技术基础上发展起来的。早在上个世纪七八十年代就有一些研究，但后来由于其役用价值的逐渐消失，驴养殖业的颓废，有关驴的研究少有人问津。从2008年前后开始，随着以驴为基础的保健和美容产品的兴起，包括驴精液冷冻保存技术在内的研究明显增多，也在诸多方面取得了积极的进展。

1 精液冷冻保存稀释液

1.1 基础稀释液

国外研究者采用的基础稀释液多为购买的商品化产品，如 INRA［1-4］、BotuSemen［1，5-6］、Botupharma［5］、Berliner Cryomedium［1］、MP 50［6］、Gent［3，7-8］、S-MEDIUM［9］、T2-94［10］等等。国内研究者则多通过研究筛选出的配方自行配制。曾维斌等［11］就5种基础稀释液对驴精液冷冻保存的效果进行了对比研究，结果发现5号基础稀释液（葡萄糖 6 g，乳糖 2 g，EDTA 0.5 g，青链霉素各 10万 IU，双蒸水100 mL）冷冻驴精液，冻后精子活力（0.37±0.04）和顶体完整率（67.7±2.66）%最高，顶体膨胀率（12.0±1.41）%、顶体破损率（14.2±1.47）%和尾部畸形率（6.17±1.47）%最低。王珂等［12］曾对3种基础稀释液的冷冻效果进行过研究，发现2号稀释液（葡萄糖5 g，果糖2 g，柠檬酸钠0.3 g，青链霉素各10万IU，双蒸水100 mL）的冻后精子活率、顶体完整率和质膜完整性最高，分别为（33.08±1.83）%、（42.67±5.39）%和（43.42±3.23）%。李建栋［13］对 2 种基础稀释液、康孟阳［14］对 5 种基础稀释液进行的研究结果都表明，配方为蔗糖7.3 g、葡萄糖2 g、二水柠檬酸钠 0.12 g、EDTA 0.13 g、NaHCO30.04 g、硫酸链霉素0.04 g、青霉素钠25 000 IU、蒸馏水100 mL的基础稀释液明显较好或最好。王慧伟等［15］对5种包括基础稀释液也不同的冷冻稀释液的研究表明，5号冷冻稀释液（乳糖7.2 g、葡萄糖3.6 g、柠檬酸钠0.25 g、青链霉素各10万IU、卵黄5 mL、甘油5 mL、双蒸水90 mL）冷冻驴精子的效果最好，冻后精子的活率、畸形率和顶体完整率分别为（0.36±0.06）%、（27.40±2.91）%和（82.20±3.85）%。张瑞涛［16］则采用在其他动物近些年比较多用的Tris-葡萄糖稀释液（Tris 35.209 g、柠檬酸19.674 g、葡萄糖15.988 g、青霉素14.5万IU、链霉素14.5万IU、双蒸水1 000 mL）进行了试验，结果与卵黄稀释液相比，加有酪蛋白的冷冻稀释液冻后的精子膜完整性及顶体完整性两个指标均显著高于卵黄稀释液。

1.2 卵黄

驴精液冷冻稀释液中卵黄的添加量，不同研究者差异很大，有的添加量为 20%［11-14，17-18］，有的为 10%［10］，有的为 5%［2，15，19］，还有的低于 5%［4，16，20-21］。从冻后精子的活率、质膜完整率和顶体完整率来看，卵黄的添加量似乎没有明显的影响。然而，在马上的研究发现，卵黄的添加量对精子的受精有明显影响。Bedford等［22］在奶基础的稀释液中添加4%的卵黄，发现马精子的受精能力出现了明显的下降，4%卵黄组的胚胎回收率为17%，而不添加组的则为50%。Jepsen等［23］的研究显示，甘油作为防冻剂且冷冻稀释液中的卵黄浓度为20%时，马的受胎率为0%；当用乙二醇代替甘油，卵黄浓度仍然是20%时，马的受胎率则为6.3%；当卵黄浓度降为5%时，马的受胎率则会提高到46.5%，因此可以看出，低的受胎率也与卵黄的高浓度有关。他的另一项研究结果表明，β-环糊精能够中和卵黄的这种损害受胎率的作用，由于β-环糊精能与脂类和胆固醇结合，因此认为卵黄中的胆固醇可能就是引起马受胎率下降的物质。Parks等［24］的研究结果表明，高胆固醇对精子细胞是有害的，它可引起人精子和马精子的不育［25-26］，可能会使精子去能，抑制顶体反应［27］。

1.3 抗冻剂

在驴精液的冷冻保存研究上，应用过的抗冻保护剂有甘油［3-4，10，13，16，18］、乙二醇［2-3，15］、DMSO［3，6，15］、二甲基甲酰胺（DMF）［3-4］和二甲基乙酰胺（DMA）［6］等，截至目前，最常用的是甘油，终浓度多为2%～5%。王慧伟［19］曾对甘油浓度（1.5%、2.5%和3.5%）进行过研究，结果显示，2.5%的甘油浓度冷冻驴的精子效果最好。与甘油相比，相同浓度的乙二醇冷冻驴精子效果并没有甘油好［15］；当2.2%的甘油浓度与1.4%的乙二醇浓度相比较时，冷冻驴精子的效果差异不明显［2］；当乙二醇浓度降为1%时，则能够显著提高精子质膜的完整性［3］。对于DMSO，Acha 等［3］和王慧伟等［15］都证明其抗冻效果明显差于甘油。而对于二甲基甲酰胺（DMFA），若用2.5%的DMFA代替甘油时，冻后精子的存活率和膜完整性明显得到提高［3］；但冻后精液的受胎率，DMFA 组（11%）较甘油组（10%）没有明显提高［4］。

2 鲜精的预处理

预处理的方法概括起来有两种，即稀释—离心—再悬浮的方法［20，28-29］和离心—再悬浮的方法［12，14-15，19］。稀释—离心—再悬浮的方法是先对鲜精进行稀释，然后进行离心，去上清液，再用冷冻稀释液进行再悬浮。离心—再悬浮的方法则与稀释—离心—再悬浮的方法相似，只是鲜精不进行稀释而直接进行离心而已。

对于鲜精的稀释，通常所用的稀释液为基础稀释液，且按照鲜精∶稀释液=1∶1～1∶3 进行稀释［2，5，20，28-29］。当然稀释时，要注意稀释液的温度要与精液相同，且稀释要缓慢进行，防止稀释打击和冷休克的发生。

稀释后，有的马上进行离心处理，如Saragusty等［1］、Oliveira 等［6］以及朴顺官等［29］试验方法，有的放置 10 min后再进行离心处理，如 Rota 等［2］、张瑞涛［16］、史福艳［18］试验方法。至于离心的速度和时间，由于受离心机离心半径、精液的质量以及精液稀释液的影响，最好进行预试验确定。为了做到既能保证精子的分离，又不至于造成对精子的损伤，Saragusty等［1］在精液下部加入预热至37℃的60%的碘克沙醇，1 000 g离心10 min，然后再去除上清液和碘克沙醇。

关于精子密度与冷冻效果的关系，Contri等［38］和曾维斌等［17］均进行过研究，然而两者研究结果刚好相反，前者对5种驴的精液研究结果表明，精子密度越高，冻后精子的质量越差；而后者的研究则发现精液浓缩能够明显提高冻后精子活力。

3 精液的降温和平衡

降温和平衡时间有 20～30min 的［5，29］，有 1～2h 的［6，14，28］，有 2～3 h 的［1，12，15，19］，也有 3～4 h 的［11，13，17-18］。至于合适的降温和平衡时间，则应是能够完成降温和平衡的最短时间，因为时间越长，抗冻剂的毒性作用就会越大。由于降温和平衡时精液的体积不同，完成降温和平衡的时间也会不同。对于细管精液的降温和平衡，Oliveira等［5］只在5℃的冰箱放置了20 min，用传统手动冷冻方法冷冻的驴精液，冻后活率达到（39.9±2.6）%。

4 精液的分装

精液的分装，目前绝大多数用的是细管法。由于驴的输精量较大，因此多用 0.5 mL 的冷冻细管［7，15，28，30］，但也有人用 0.25 mL 的细管［12，14］。Saragusty 等［1］和 Pablos等［31］用Hollow管冷冻保存驴精液，也取得了不错的效果。至于精液分装的时间，不同研究者也有区别，有的在平衡后分装［2，7，14］，有的则在降温前分装［6，18，20］。

5 精液的熏蒸冷冻

精液的冷冻有传统的手工冷冻和冷冻仪自动冷冻。传统的手工冷冻就是将平衡好的精液放在加有液氮的泡沫箱中在离液氮面一定高度而进行的冷冻。这种方法成功的关键在于冷冻时精液距离液氮面的高度，高度不同温度就有差异，造成精液的降温速度就不同，冷冻效果自然也会不同。从已有的研究资料来看，这一高度并不确定，有 1 cm 的［11，17］、2 cm 的［15］、3 cm的［13，18，29］、4 cm 的［14，29］，还有 6 cm 的［5-6］，至于哪个高度最合适，恐怕与泡沫箱的大小、结构以及泡沫箱内液氮的多少等有关，应在试验中对比研究确定。关于熏蒸时间，也有不小的差异，总的来说，国内研究者的液氮熏蒸时间较短，通常在 15min 以下，最常用的是 7～8 min［11，15，17，19］，李建栋［13］、史福艳等［18］还用 3 min 进行过熏蒸冷冻；国外研究者的熏蒸时间则较长，通常不低于 15 min［1，5-6］。近年来，也有人开始将冷冻胚胎的程序冷冻仪应用于驴精子的冷冻［2，5，16］。Oliveira 等［5］对传统的手工冷冻方法与自动的程序冷冻方法（5～-10℃时的降温速度为-15℃/min，-10～-140℃时的降温速度为-40℃/min）进行过对比研究，结果发现程序冷冻方法冷冻的驴精子，冻后活率为（44.5±3.9）%，而传统手工冷冻方法冷冻的驴精子，冻后活率为（39.9±2.6）%，程序冷冻方法优于传统手工冷冻方法。

6 精液的解冻

根据解冻温度可分为低温解冻（0～5℃）、常温解冻（15～25℃）、体温解冻（37～40℃）和高温解冻（＞45℃）。从现有的资料来看，大部分人采用的是体温解冻，即在37～40℃的水浴中进行 20～30 s 的解冻［1-2，8，12，14］，有的在水浴前还在空气中停留 3 s 或数秒［13，18-19］。易理辉等［20］曾用5℃水浴解冻过袋装驴精液。Oliveira等［5］则用46℃20 s的方法解冻过细管驴精液。王慧伟等［15］对冷冻驴精液的解冻温度进行过研究，发现40℃的解冻效果最好。袁玮等［32］则用5℃、38℃和手搓对驴冷冻精液的解冻进行过研究，发现38℃水浴锅解冻30 s时的精子活力最高。

7 解冻精液的处理

Rota等［2］对解冻后的精液稀释液进行了研究，发现解冻后的精液若用精浆（SPL）和INRA稀释液进行稀释，精子的存活率和活力INRA稀释液组明显高于SPL组，然而从输精后的受胎情况来看，SPL和INRA稀释液组的受胎率分别为61.5%和23.1%，似乎精浆的加入具有提高冻后精液人工授精受胎率的趋势。Sabatini等［33］也做了类似的试验，同样发现解冻后的驴精液用70%的自体精浆以及5%或20%的异体精浆处理，也会降低冻后精子的存活率、活率以及膜完整性。Ortiz等［34］则对解冻后的精液进行了单层密度离心研究，发现用Androcoll-E-Small或胶体进行单层密度离心的精液，精子质量系数明显高于未离心组。而且低耐冻性的精液，在进行单层密度离心后，精液质量提高得更明显［35］。Trimeche等［10］的研究发现，解冻后的精液只有去除甘油后才能受孕怀胎。

8 冷冻精液的受胎率

由于人工授精输入的有效精子数和输精部位等的不同，授精的受胎率也各不相同。Rota等［2］和王慧伟［19］将3亿以上的有效精子输入子宫体深部，每个情期输精1～2次，在不补加精浆的情况下，分别获得20%～31%和42.9%的情期受胎率。Saragusty等［1］则将有效精子数增加到4.8亿以上，在子宫体输精2次的情况下，获得50%的情期受胎率，似乎提高有效精子数能够提高发情母驴的受孕率。然而Oliveira等［5］将输入的活精子数提高到10亿，子宫体授精的受胎率为0%，而子宫角深部授精的受胎率则为28.3%。国内张瑞涛［16］也进行了子宫角深部冻精输精，输入活力≥35%的5支细管精液后，母驴3个情期的受胎率为63.9%。

总之，驴的精液冷冻保存技术在近些年来取得了长足的进步，冻后精子活率及其受胎率都有了一定的提高，但其受胎率离人们的期望还有较远的距离，相信随着驴精液冷冻保存技术和人工授精技术的进一步发展，其必将在驴的良种繁育和品种改良中发挥更加重要的作用，必将有力地推动驴养殖业的快速发展。