甲状腺癌RNA分子研究进展

林琳，刘建华，吴丽娜

0 引言

甲状腺癌是内分泌系统中最常见的恶性肿瘤，甲状腺癌的发病率在世界范围内持续增长。Siegel等[1]对美国近几年甲状腺癌的发病率、死亡率进行统计分析发现，甲状腺癌女性患者多于男性，女性甲状腺癌发病率已位列恶性肿瘤的第五位，仅次于乳腺癌、肺癌、直肠癌和宫颈癌。甲状腺癌可分为：来源于滤泡旁细胞的甲状腺髓样癌和来源于滤泡细胞的甲状腺癌。根据分化程度的不同，又将其分为分化型甲状腺癌和未分化型甲状腺癌。分化型甲状腺癌主要包括甲状腺乳头状癌（papillary thyroid cancer,PTC）与甲状腺滤泡性癌（follicular thyroid cancer,FTC）。其中，甲状腺乳头状癌的发病率较高，占甲状腺癌的80%～85%[2]。甲状腺癌的发病机制尚不清楚，多数研究者在基因水平对甲状腺癌进行了大量研究，发现RET、BRAF[3]等基因在甲状腺癌的发生、发展以及转移中发挥重要作用。尽管，已有研究证实，信使RNA（messenger RNA,mRNA）、微小RNA（microRNA,miRNA）、长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）与环状RNA（circular RNA,circRNA）对细胞生物学行为以及基因表达调节起关键作用，但是，迄今为止，甲状腺癌相关RNA分子在甲状腺癌的研究中仍较少，且其在甲状腺癌发生机制中的具体作用尚不明确。本文拟对甲状腺癌相关RNA的研究进展作一综述。

1 肿瘤相关RNA的概述

RNA是存在生物细胞的遗传信息载体，对细胞生物学行为具有关键的调控作用。其中，mRNA主要参与正常细胞转录和翻译过程，mRNA翻译、甲基化修饰失调[4-5]以及mRNA与miRNA相互作用失衡都有助于肿瘤的发生。近两年来许多研究人员对多种非编码RNA在肿瘤发生、发展及转移过程中的作用机制进行了深入研究。已有研究证实：lncRNA可通过改变染色质修饰水平，调节mRNA的加工并调控蛋白活性[6]，从而影响肿瘤的发生与进展。另外，有研究者表明mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA可作为竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）相互作用，形成ceRNA调控网络，在肿瘤发生、发展过程起一定的作用[7]。lncRNA与circRNA可作为ceRNA分子，具有miRNA海绵的功能，通过竞争性结合miRNA上的RNA结合蛋白位点，从而调控基因转录、翻译等过程，在肿瘤发生过程中起关键作用[8]。因此，各类RNA在肿瘤发生、增殖和侵袭转移等过程中起重要调控作用。

2 甲状腺癌相关RNA

随着甲状腺癌发病率的增长，研究者们对mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA在甲状腺癌发生中的作用机制进行深入探索，为甲状腺癌的诊断和治疗提供了新思路。

2.1 mRNA

mRNA是携带遗传信息的一类单链核糖核苷酸，参与生物的转录与蛋白翻译过程，而肿瘤细胞具有较强的生长、繁殖能力，肿瘤发展过程需要更多的蛋白质支持。mTOR是一种丝氨酸苏氨酸激酶，有研究发现肿瘤中mTOR的过度激活导致mRNA翻译失调，使机体蛋白质合成速率增加，从而促进肿瘤的生长与转移[5]。此外，Pinello等[4]通过研究证实：mRNA甲基化修饰的失调有助于肿瘤的发生，N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）修饰的mRNA水平检测可能是一种新型生物分子标志物检测技术，对甲状腺癌的早期发现和治疗具有重要的临床意义。因此，对临床活检标本中mRNA异常表达的检测，有助于患者的早期诊断、预测肿瘤预后并提供适宜的治疗方法。其中，BRAF mRNA是研究较多的mRNA，在PTC发生和发展中起重要作用。

BRAF突变是PTC中最常见的基因改变，在40%～45%的PTC中可发生BRAF突变，其中99.7%是BRAFV600E突变[9]。BRAF mRNA表达水平的异常改变与甲状腺癌的发生存在一定的联系。Marranci等[10]研究发现，miRNA是BRAF基因表达的调控因子，miRNA介导BRAF基因表达的转录后调控。其中mir-125b-1-3p、mir-181b-5p、mir-3180、mir-3180-3p和mir-3651是BRAF靶基因表达的阳性调节因子，可增加BRAF mRNA及其内源性BRAF蛋白质的表达。有研究者[11]在癌症基因组图谱中选择了353例PTC，包括193例BRAFV600E突变型PTC和160例BRAF野生型PTC。运用RNASeq和期望最大化算法测量mRNA丰度。经过统计分析后发现，BRAFV600E突变型PTC患者中BRAF mRNA水平明显高于野生型BRAF的PTC患者。进一步研究发现，BRAF mRNA的高水平表达与PTC的侵袭性有关，BRAF mRNA表达水平的检测有助于对PTC预后危险分层的评估。Araujo等[12]采用实时定量PCR和PCR-RFLP检测BRAF mRNA表达水平，以确定BRAFV600E基因突变。结果表明，BRAF mRNA表达的差异，有助于确定BRAFV600E突变的存在来区分甲状腺乳头状癌与甲状腺肿物。因此，BRAF mRNA表达水平的检测有利于鉴别甲状腺乳头状癌，评估甲状腺癌侵袭、淋巴结转移分期，有助于甲状腺癌的临床诊断与治疗。

此外，Choi等[13]研究发现，甲状腺癌组织中维生素D受体基因（vitamin D receptor gene,VDR）表达高于正常组织，VDR表达与BRAFV600E突变和复发之间也存在着相关性。维生素D3的活性形式1，25-二羟基维生素D3通过结合VDR发挥抗肿瘤活性，维生素D受体可能是治疗甲状腺癌的潜在靶点。还有研究表明[14]在大多数PTC组织中von Hippel-Lindau（VHL）肿瘤抑制基因的表达降低，VHL的低表达与甲状腺癌外扩散和包膜侵犯显著相关。甲状腺相关mRNA可作为PTC患者潜在的诊断生物标志物和预后预测因子。随着甲状腺癌发病率的上升，迫切需要我们研究更多新型的甲状腺相关mRNA从而改善甲状腺癌的早期诊断和治疗。

2.2 miRNA

miRNA[15]是一组长度为18～22 nt的短链非编码RNA。有研究[7]发现，miRNAs可以通过与靶向RNA转录物的3个非翻译区（3’-UTRs）上的miRNA反应元件（MREs）不完全结合来抑制其靶基因，并通过降解mRNA或抑制翻译过程来降低靶蛋白的表达。miRNA是癌基因和抑癌基因转录、翻译调控的关键分子，在转录后过程中也起到重要的调节作用。miRNA的异常表达调节肿瘤细胞生长、增殖和凋亡等。据相关研究[16]报道，miRNA-221/222可作为区分甲状腺结节有效的生物标志物，但miRNA在甲状腺癌中的作用机制仍然需要科研工作者进一步探索。

miRNA被认为是甲状腺癌最具潜能的新型生物学标志物之一。它们通过负向调节其靶向mRNA稳定性或翻译过程，或靶向作用于相关蛋白受体，而在细胞增殖、凋亡和生长等细胞生物学过程中发挥关键作用[16]。研究者[17]通过实时定量PCR对109例PTC组织和配对的邻近正常甲状腺组织miR-299的表达水平进行检测，发现PTC组织中miR-299-5p的表达明显低于配对的癌旁正常甲状腺组织。进一步利用细胞迁移、侵袭实验与荧光素酶报告基因检测等方法研究其作用机制发现，而miR-299-5p的过表达则抑制甲状腺癌细胞的迁移和侵袭。此外，研究发现雌激素受体（estrogen receptor,ER）在PTC组织中明显增高miR-299-5p通过靶向作用于ER，从而调节甲状腺癌的进展。ER的过表达能够削弱miR-299-5p对甲状腺癌细胞的抑制作用，促进甲状腺癌的发生。miR-299-5p参与甲状腺癌的转移与侵袭，miR-299-5p可能成为甲状腺癌治疗的靶基因。因此，深入研究甲状腺癌发病的分子机制，对实现有效的个体化治疗具有重要意义。

Zheng等[18]通过实时定量PCR对165例PTC患者血清样本中miR-203的表达进行评估。分析结果显示，与无复发的PTC患者相比，肿瘤复发的PTC患者血清中miR-203表达显著升高。提示血清miR-203表达可作为预测PTC复发和预后的非侵入性肿瘤分子标志物。从临床实践意义分析，血清miR-203检测方法能够减少对患者的创伤，检测起来更加方便，有利于对甲状腺癌患者的筛查，让患者得到更好的治疗。

2.3 lncRNA

lncRNA[19]可存在于细胞核或细胞质中，是一类超过200个核苷酸长度无编码能力的转录物。在过去，lncRNA转录本一直被认为是一类转录噪声。然而，有研究发现，细胞核内的lncRNA可介导染色体基因调节复合物进入特定的基因组位点，并通过染色体修饰来调控基因的表达。细胞核lncRNA可参与mRNA与miRNA的加工。另外，能够与其转录因子形成特定的复合物，从而影响基因的表达。而胞质中的lncRNA则参与mRNA稳定性的调节，并具有miRNA海绵的功能，从而调控基因的表达。lncRNA可作为转录、mRNA加工以及转录后等生物学过程中重要的调节因子。还有研究表明，lncRNA[6]还可作为信号分子，存在于外泌体中，调节细胞间信息传递。lncRNA也是肿瘤发病机制中重要调节物，参与肿瘤细胞的凋亡、侵袭和迁移。近年来，多个研究表明，lncRNA通过调节相关基因的表达，促进或抑制膀胱癌、胃癌、甲状腺癌等疾病的发生、发展。组织细胞中相关lncRNA基因的检测，可能成为癌症诊断和预后重要标志物。lncRNA的表达在甲状腺癌发病机制中起重要作用，其中常见的与甲状腺癌相关的lncRNA包括：生长停滞特异性基因5（growth arrest-specific5,GAS5）、肺腺癌转移相关转录子1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1）以及甲状腺乳头状癌易感候选基因3（Papillary thyroid carcinoma susceptibility candidate 3,PTCSC3）。

GAS5是一种长度为650个碱基的lncRNA，在生长停滞期间高水平表达。这种lncRNA最初是在1998年利用减法杂交从NIH3T3细胞系中分离出来的。到目前为止，已经检测到至少4个GAS5的剪接变异体[20]。多个研究表明，GAS5 lncRNA影响肿瘤细胞的生长、增殖，在直肠癌、膀胱癌、乳腺癌等癌症中表达失调，并证实了该分子在肿瘤中的抑制作用。Guo等[21]应用定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）检测甲状腺癌和良性肿瘤组织中lncRNA GAS5的表达水平，甲状腺癌组织中的lncRNA GAS5表达较良性甲状腺肿瘤组织显著降低。另外，lncRNA GAS5的表达与肿瘤分期、淋巴结转移及肿瘤的多发癌灶密切有关。但GAS5 lncRNA在甲状腺癌中的表达水平及作用机制尚不清楚，需要进一步研究。

MALAT1又称为核富集丰富转录子2（nuclearenriched abundant transcript 2,NEAT2），是位于染色体11q13上的长链非编码RNA[22]。Ji等[23]最初在早期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中发现MALAT1，并被确定为NSCLC的独立预后生物标志物。大量研究表明，MALAT1表达的上调促进乳腺癌、肝癌等癌细胞的增殖、侵袭及转移能力。也有研究表明[24]，MALAT1在PTC组织中的表达水平显著增加，其表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移和WHO分期相关联。MALAT1是PTC的潜在诊断标志物，对MALAT1在甲状腺中作用机制的研究有助于探讨甲状腺癌的新型诊断与治疗手段。

甲状腺乳头状癌易感候选基因3（papillary thyroid carcinoma susceptibility candidate 3,PTCSC3）最初是由Jendrze在甲状腺中发现的长链非编码RNA之一[25]。Wang等[15]通过实时定量PCR和蛋白印迹技术检测基因以及荧光素酶报告基因实验检测等，研究发现PTCSC3/miR-574-5p通过SCAI调节Wnt/β-catenin的活性，介导PTC细胞的增殖和迁移，并通过体内实验验证了过表达PTCSC3抑制肿瘤的生长。多个研究发现lncRNA在甲状腺癌中起重要的调控作用。对甲状腺癌相关lncRNA的研究，有利于新型标志物的发现，能够有效地减少过度诊断和治疗，为甲状腺癌的分子靶向治疗奠定基础。

2.4 circRNA

circRNA[26]代表了一类新的内源性非编码RNA，它没有5′或3′末端，而是由共价键相互连接形成一个封闭的环状结构。由于没有可以接近的末端，circRNA对核酸外切酶具有抗性，这使得circRNA比线性RNA亚型更稳定。近年来有研究发现，circRNA可以竞争性结合miRNA上的RNA结合蛋白位点，来影响由竞争性内源性RNA（ceRNA）网络调控的特定基因的表达，从而导致肿瘤的发生[8]。

Cai等[27]用RT-PCR检测了PTC组织和PTC细胞系中circBACH2（hsa_circ_0001627）的表达。发现circBACH2在PTC组织和PTC细胞系中高度表达。采用FISH技术、荧光素酶报告法和ago2-rip法证实了circBACH2可以直接与mir-139-5p结合，并减轻LIM-only4（LMO4）对靶细胞的抑制作用，从而促进肿瘤的发展。该项研究表明circ-BACH2是一种新型致癌RNA，可以海绵化miR-139-5p，并可作为PTC的肿瘤生物标志物，也为制定PTC的临床治疗策略提供新的有力依据。

另外，研究者[28]通过PCR技术在PTC组织和PTC细胞系中测circRNA_102171的表达，并利用克隆技术以及细胞迁移侵袭实验技术，对circRNA_102171在甲状腺癌中的作用机制进一步研究。结果表明：circRNA_102171在肿瘤组织和细胞系中表达上调。circRNA_102171沉默会抑制PTC细胞增殖、迁移和侵袭，同时促进细胞凋亡。其过表达通过CTNNBIP1依赖的方式激活Wnt/β-catenin通路促进PTC进展。越来越多的研究表明，circRNA在肿瘤的发生、侵袭和转移过程中起重要作用，这些特征使circRNA成为多种疾病的潜在分子生物标志物。

3 ceRNA

最近两年研究者发现mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA相互作用，形成ceRNA通信调节网络。ceRNA是一种RNA转录产物，它可以通过降低靶向miRNA的浓度，使具有共同miRNA应答元件（MREs）的其他信使RNA（mRNAs）去阻遏而相互通信[7]。

lncRNA与circRNA可以作为miRNA海绵，与miRNA结合，从而调节miRNA的功能，并在调控转录及转录后基因表达中发挥重要作用。lncRNA、circRNA二者分别与相关的miRNA、mRNA形成lncRNA-miRNA-mRNA与circRNAmiRNA-mRNA两种调控网络，参与调节肿瘤细胞的生长、增殖和转移。有研究表明，lncRNA、circRNA存在相应的miRNAs反应元件（MRES），能够作为ceRNA，内源性竞争结合miRNA位点，从而影响miRNA的活性，进而影响靶mRNA的翻译水平[8,29]。Liu等[30]通过基因芯片分析发现，circEIF6在PTC中高度表达，而miR-144-3p在PTC细胞中的表达低于癌旁组织。利用质粒构建及细胞转染、双荧光素酶报告基因实验等检测技术发现，circEIF6通过靶向miR-144-3p调节TGF-β，从而影响甲状腺癌对顺铂治疗的耐药性。研究结果发现，circEIF6可通过激活肿瘤细胞的自噬作用来增强顺铂耐药性。当circEIF6被抑制时，miR-144-3p的表达增加，顺铂耐药性减弱，体内和体外的TGF也下降。深入探讨各种RNA在甲状腺癌中的作用，为甲状腺癌靶向治疗方式提供新视野。近年的研究揭示ceRNA在甲状腺癌中起关键的调控作用，而ceRNA中各种类型的RNA在甲状腺癌的具体发病机制仍然需要我们做更深入的研究。

4 展望

甲状腺癌的发病率逐年增长，尽管大部分患者可进行手术治疗，预后较好，但仍存在过度诊断和治疗情况。甲状腺癌的诊断主要基于组织病理学，但组织病理学报告在术后才能获得，这种情况下，与某些组织病理学特征相关的遗传生物标志物的术前使用可能有助于临床医生制定最适合的治疗方案。甲状腺癌中差异性表达的不同类型RNA都有望成为新型甲状腺肿瘤分子标志物潜能，对预测甲状腺癌的预后等方面有重要的临床意义。此外，在血循环中检测甲状腺相关RNA能够减少对患者的创伤，并且更加方便快捷，为进一步研究甲状腺癌发生、发展的生物分子机制提供新思路，对于诊断、预测甲状腺癌有广阔的应用前景。