APP下载

柴油机尾气颗粒提取物对皮肤角质形成细胞蛋白组学的影响及抗氧化剂在皮肤健康中的作用

2019-01-06

中华皮肤科杂志 2019年8期
关键词:角蛋白角质尾气

众所周知,空气污染威胁着人类的健康,而工业和车辆排放的废气是户外空气污染最主要的来源。柴油机排放物主要包括大小不同的碳质颗粒、脂肪烃、多环芳烃(PAH)及其衍生物、一氧化碳、硫和一氧化氮等气体。柴油机尾气颗粒物对人体造成有害影响的主要机制是诱导氧化应激,而氧化应激是导致皮肤外源性老化的一个重要因素。

除颗粒物外,柴油机尾气还含有醛类、苯、1,3-丁二烯、PAH和硝基PAH等,也会对人体产生刺激的挥发性混合物。颗粒物表面会吸附40多种已知和300多种未知的PAH,占柴油机尾气中挥发性成分的绝大多数。许多体内和体外研究已将PAH和活性氧(ROS)产物的细胞代谢与细胞毒性联系了起来。有研究表明,柴油机尾气和香烟烟雾中的PAH可以引发呼吸道炎症反应。最近有研究还显示PAH与UVA1协同作用来破坏皮肤角质形成细胞的内稳态。尽管许多研究分析了柴油机尾气中气相组分的影响,但关注重点是PAH,缺乏对总气相的无偏性研究。目前还没有皮肤长期暴露于柴油机尾气颗粒提取物(DPE)及其蒸气下的高通量研究。

本研究旨在阐明长期暴露于柴油机尾气对皮肤原代角质形成细胞(NHEK-Ad)的影响。采用定量蛋白组学的方法观察角质形成细胞暴露于DPE或其蒸气(DPE-V)时分子水平的改变,并进行基于质谱的蛋白组学分析,定量4 490个蛋白质。其中,在暴露于DPE和DPE-V相的角质形成细胞中分别发现有201个和374个蛋白质的表达变化均大于1.5倍(P≤0.05)。该研究表明,DPE及其蒸气可显著改变几种蛋白的表达。据报道,这些蛋白参与维持皮肤上皮完整性,调节皮肤水合作用和氧化应激,同时维生素E处理能够减轻DPE或其蒸气对皮肤的不良影响。

一、材料和方法(详见原文)

二、结果和讨论

建立新细胞模型来研究长期暴露于DPE及DPE-V对人皮肤原代角质形成细胞的影响,作用后的细胞组分别为NHEK-Ad-DPE和NHEK-Ad-DPE-V。已知柴油机尾气及其中的PAH和衍生物会增加ROS水平来影响细胞的信号转导和氧化还原平衡。有研究证实,柴油机尾气颗粒物可以产生ROS,引起氧化损伤并增加ROS的产生或蓄积,导致组织损伤。此外,ROS增加还会涉及包括老化和皮肤损伤在内的多种细胞过程。

1.长期暴露于DPE及DPE-V可诱导核因子红细胞2相关因子2(NRF2)表达:为中和ROS的毒性作用,一些抗氧化蛋白和某些解毒酶,如NADPH醌氧化还原酶、γ谷氨酰胺半胱氨酸合成酶和血红素氧合酶1,会通过抗氧化反应元件被转录因子激活。NRF2是负责抗氧化反应元件调控基因构成性和诱导性表达的转录因子。蛋白印迹结果显示,NHEK-Ad-DPE-V和NHEK-Ad-DPE中NRF2的表达相对于NHEK-Ad细胞有所增加。

2.DPE及其蒸气暴露会导致角质形成细胞中普遍的蛋白组学改变:采用基于串联质谱标签(TMT)的定量蛋白组学方法研究长期暴露于DPE或DPE-V中的皮肤角质形成细胞内蛋白质组学的变化。共有4 490个蛋白质被定量和反复验证,分别在NHEK-Ad-DPE-V和NHEK-Ad-DPE中发现374个和201个蛋白质表达变化程度≥1.5倍(P≤0.05)。

两组细胞中出现表达变化的蛋白包括角蛋白A、Suprabsin亚型1和抗白细胞蛋白酶。角蛋白A属于SPRR蛋白家族,是一种参与角化过程的结构蛋白。抗白细胞蛋白酶或分泌性白细胞肽酶抑制剂是一种分泌抑制剂,可保护上皮组织免受丝氨酸蛋白酶的影响。

该研究还用DPE及DPE-V处理体外重建表皮模型EpiSkin(RHETM EpiSkinTM),数据重现了前面细胞体外培养所观察到的蛋白组学结果。

正常角质形成细胞可以在支持增殖的培养基中生长。然而,暴露于DPE和DPE-V可导致一些参与细胞分化过程的蛋白表达变化。该研究采用生物信息学分析来阐明由于皮肤角质形成细胞慢性暴露于DPE或DPE-V中可能受到影响的生物过程。

3.暴露于DPE或DPE-V会影响与皮肤屏障功能及皮肤完整性相关的蛋白质:在两组细胞中发现,多种具有皮肤生物学作用的蛋白均出现表达变化。两组中均观察到斑蛋白家族成员下调,包括周斑蛋白、包斑蛋白、外皮蛋白和epiplakin。斑蛋白家族是角质形成细胞中完成角质化上皮形成和维持上皮屏障完整性所必需的。两组暴露条件的细胞内,维持上皮屏障完整性的半胱氨酸蛋白酶抑制剂A、半胱氨酸蛋白酶抑制剂B、sciellin、角蛋白A、角蛋白B和富含脯氨酸的小蛋白2D等蛋白均显著下调。此外,在皮肤水合过程中起重要作用的丝聚蛋白也出现下调。

两种损伤下,Ⅰ型和Ⅱ型角蛋白家族的表达均明显下调。Ⅱ型细胞骨架角蛋白80参与细胞分化,且对维持上皮细胞结构的完整是必需的,其表达在NHEK-Ad-DPE-V中下调了20%,在NHEK-Ad-DPE中下调50%。Ⅱ型细胞骨架角蛋白1(KRT1)和I型细胞骨架角蛋白10(KRT10)是角化过程中不可或缺的一对蛋白,赋予了细胞和整个表皮的机械完整性。KRT1-KRT10蛋白在两种暴露下均出现下调。

4.DPE-V影响体外培养皮肤角质形成细胞的不同细胞过程:DPE-V由多种挥发性有机成分组成,会危害人皮肤,尤其是PAH及其衍生物,被认为可以通过线粒体ROS的产生和随后的线粒体损伤来诱导皮肤外源性老化。蛋白质网络分析显示,NHEK-Ad-DPE-V表现出独特的参与线粒体氧化磷酸化的相互作用蛋白簇。

(1)DPE-V暴露后线粒体氧化磷酸化蛋白的表达变化:蛋白质相互作用分析可以鉴定线粒体复合体I如NADH的蛋白组分,包括泛醌氧化还原酶亚基A7(NDUFA7)、NDUFA4、NDUFV2、NDUFS4、NDUFA2、NDUFS6、NDUFB7、NDUFS1,其过表达≥1.5倍(P≤0.05)。此外,在暴露于DPE-V的细胞中,线粒体复合物Ⅳ的组分包括细胞色素C氧化酶亚基7C(COX7C)、COX5B、COX6C、COX2、COX7A2、COX4I1、COX6B1以及泛醇-细胞色素C还原酶、复合物Ⅲ亚基X也过度表达(≥1.5倍,P≤0.05)。线粒体电子传递链复合物在ROS如超氧化物、过氧化氢和羟自由基产生中的作用已被广泛证实。线粒体复合物Ⅰ可以形成电子进入氧化磷酸化的主要入口点,复合物Ⅰ和Ⅲ的活性增加可导致ROS的生成增加。总之,蛋白组学数据分析揭示了参与氧化磷酸化的线粒体蛋白表达变化,可能导致细胞内ROS增加,损伤皮肤。

(2)暴露于DPE-V对调控细胞迁移蛋白的影响:整合素是一种异二聚体的跨膜受体,参与了角质形成细胞迁移和伤口愈合。整合素α2β1已被证实是角质形成细胞迁移的必需因素。在伤口闭合过程中的迁移前沿和伤口愈合时新形成的表皮中,也已证实存在整合素α2β1的过表达。在NHEK-Ad-DPE-V中观察到整合素β1(ITGB1)、ITGA2和ITGA3的显著过度表达。除了整合素之外,在暴露于DPEV的细胞中还可以观察到细胞外基质(ECM)蛋白如胶原蛋白α1(Ⅶ)(COL7A1)、COL17A1和COL18A1的过度表达。COL7A1参与角质形成细胞的黏附和p38MAPK依赖性迁移。COL17A1基因敲除还与角质形成细胞的移动减少有关。

基质金属蛋白酶(MMP)是参与ECM蛋白转化和降解的内肽酶。该研究的蛋白组学数据显示,在NHEK-Ad-DPEV中,MMP14过度表达显著,组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP2)则表达下调。MMP14介导的前MMP2活化已被证实在细胞迁移和上皮伤口愈合中具有重要作用。已知TIMP2可以特异性抑制MMP14介导的MMP2活化。有趣的是,参与细胞迁移的蛋白质似乎主要是在暴露于DPE-V的细胞中过表达,可能是细胞对DPE-V的防御反应。然而,在暴露于DPE的细胞中没有观察到这种细胞反应,这可能提示直接暴露于DPE对皮肤角质形成细胞的影响更强。

5.维生素E能部分修复角质形成细胞中由DPE及DPE-V导致的分子水平改变:用9 IU/ml维生素E处理暴露于DPE和DPE-V的细胞,暴露于DPE-V及DPE的细胞NRF2表达均降低。两种暴露的细胞经维生素E处理后也会出现明显聚集。蛋白组学分析显示,维生素E处理可以使NHEKAd-DPE-V的374个表达发生变化的蛋白中约97%恢复至基础水平。对于NHEK-Ad-DPE,维生素E处理能使201个表达发生变化的蛋白中约61%恢复至基础水平。该结果表明,与暴露于DPE-V相比,直接暴露于DPE的作用更强。

维生素E处理可恢复参与皮肤角质层形成、脱屑、水合作用和结构完整性的蛋白表达水平,提示维生素E可减轻暴露于DPE和DPE-V对皮肤原代角质形成细胞的影响。维生素E处理还可以恢复暴露于DPE-V的细胞中线粒体复合物I和复合物IV的蛋白表达。表明维生素E等抗氧化剂对受DPE-V中氧化剂慢性影响的皮肤细胞具有保护功效。

观察维生素E处理对NHEK-Ad-DPE-V迁移能力的影响发现,暴露组细胞的迁移率比对照组增加40%。因此,维生素E处理还可以部分恢复该影响。

6.角质形成细胞中DPE及DPE-V诱导的表达变化分子的鉴定和维生素E的恢复作用:研究者还在两组细胞中发现了许多发生表达变化的新蛋白。在NHEK-Ad-DPE-V和NHEK-Ad-DPE中,核仁和螺旋体磷蛋白1及凋亡拮抗转录因子等蛋白过度表达。此外,两组细胞均发现了非特异性细胞毒受体蛋白1同源物等蛋白下调。维生素E处理可以使两种细胞的这些蛋白质水平恢复。该发现的生物学意义尚不清楚,还需进一步研究。

7.维生素E可以恢复暴露于DPE和DPE-V的细胞中涉及桥粒完整性蛋白的表达:暴露于DPE或DPE-V可以导致几种与桥粒完整性有关的蛋白表达下调,如桥粒斑蛋白、斑菲素蛋白1和corneodesmosin。这些桥粒蛋白的突变或功能丧失与多种皮肤疾病有关。维生素E处理可以使DPE和DPE-V暴露细胞中这些蛋白的大多数恢复到近似未暴露的水平。接下来,了解这些蛋白质在皮肤生物学中的生物学意义会是有趣的工作。

总之,该蛋白组学研究强调了暴露于DPE和DPE-V所导致的分子变化的差异。直接暴露于DPE和DPE-V被证实可以改变参与维持皮肤完整性蛋白的表达水平。这些改变在体外重建皮肤模型中也得到重现。在DPE和DPE-V暴露细胞中,与细胞有丝分裂周期和染色体结构相关的蛋白表达也明显改变。此外,DPE-V对线粒体氧化磷酸化和细胞迁移等生物学过程具有明显的影响。使用抗氧化剂维生素E处理,还可以部分恢复DPE和DPE-V暴露细胞中发生改变的蛋白表达,这一发现强调了抗氧化剂在抵御空气污染对皮肤损伤中的重要性。

猜你喜欢

角蛋白角质尾气
羊毛角蛋白的提取及其在大健康领域的应用进展
角蛋白家族基因及其与动物毛发性状关系的研究进展
化工生产过程中的尾气处理工艺技术探析
羊毛角蛋白改性纤维素膜的结构和性能
角蛋白在皮肤老化过程中的研究进展
鲸吞
机动车尾气污染物排放和控制探究
翻新肤色“角质”大扫除
角质攻防战即刻拥有完美肤色
汽车维修企业“尾气治理”项目的建立与运营