猪圆环病毒不同基因型毒株间在自然条件下发生基因重组的研究进展

丁鹏 王志全 范懿娜

(1，山东省青岛西海岸新区农业农村局 266400；2，山东省青岛西海岸新区农业农村局 266400)

猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）为圆环病毒科圆环病毒属（Circovirus genus）成员，病毒粒子直径为17nm，呈二十面体对称，为圆形小颗粒状，是目前已知最小的动物病毒之一[1-2]。根据病毒的基因组和血清学特征分为2 个型：PCV1 和PCV2。PCV1 为PK15 细胞系的一种污染物，对猪无致病性，因此，有关PCV1 的研究较少，而PCV2 对猪有致病性，能引起以断奶仔猪多系统衰竭综合征 （Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）为主要特征的一系列疾病。PMWS于1997 年首次在加拿大证实，自2004 年以来，世界范围内养猪业相继出现猪圆环病毒相关性疾病（Porcine circovirus associated disease，PCVAD) 的爆发[3-4]，该次大规模流行以高覆盖率、高发病率和高致死率为特征，危害相当严重，给世界范围内养猪业造成巨大经济损失，近年来成为世界范围的研究热点。PCV1 与PCV2 具有相似的基因组构成，两者基因组相似性约为70%。病毒基因组由单股负链闭环状DNA 组成，PCV1 含1758 核苷酸（nt），PCV2 由1766～1768nt 组成。这两种病毒包含3 个主要阅读框（ORFs）构成，其中ORF1 编码蛋白与病毒复制酶有关；ORF2 编码病毒主要结构蛋白，也是病毒保护性抗原主要成分；ORF3 编码蛋白具有诱导细胞凋亡功能，并与病毒在机体内的致病性有关[5-6]。国际上将PCV2 统一规范命名，分为PCV2a、PCV2b 和PCV2c 三个基因型[7-8]。自2000年，有关PCV2 遗传变异的报道增多[9-10]，相对PCV2 自然重组变异的报道较少。近来，PCV 重组作为其分子遗传变异的又一重要领域，涉及该病毒的自然重组变异机制、自然重组对其致病性及免疫原性的影响。本文归纳了近年来有关PCV 自然重组模式的研究进展，旨在为今后该病毒的重组机制及致病性研究提供借鉴。

1 PCV2 同种基因型间的重组

目前，在世界范围内猪群中流行的主要以PCV2a 和PCV2b两种基因型，以PCV2a 为主要基因型向PCV2b 为主要基因型转型的趋势。通过对国内不同地区送检的病料样品进行检测和PCV2 基因组序列分析，新发现了2 个可疑的重组序列09GS（HQ395028）和HN0907 （GU938303），这2 个重组序列为09CQ （HQ395024）和Zhuji 2003 （AY579893）两个亲本毒自然重组导致的。全基因序列分析，该2 个亲本毒均为PCV2b 基因型，通过不同的重组模式进行，重组交换位点分别位于ORF1 和ORF2[11]，研究表明，自然重组引起PCV2 遗传变异的多样性。此外，欧洲学者从临床PMWS 病例分离到一株PCV2b重组毒株，重组位点分别位于762～871nt 和1335～1372nt[12]，其中762～871nt 位点临近已报道的重组位点 （716～751nt 和963nt），而1335～1372nt 位点为首次报道。该位点位于ORF2内，与已报道的重组位点不同（1057～1167 和1712～1727）[13]。该研究表明，重组毒株与亲本毒株相比具有较好的体外繁殖特性，预示着PCV2b 间重组将导致临床PCV2 新基因亚型的出现。据香港学者研究发现，有3 个来自香港的PCV2 重组序列，经预测重组位点位于PCV2 复制原点和复制酶基因，还证实GenBank 中来自中国大陆的PCV2 序列也存在自然重组现象，与香港报道的重组模式相似[14]。

2 PCV2 不同基因型间的重组

对PCV2 流行毒株的遗传变异分析表明，猪群中流行的PCV2a 和PCV2b 毒株存在共感染现象，这为不同基因型间在感染猪体内发生自然重组提供先决条件。来自韩国报道，对2005～2007 年间扩增的PCV2 全序列，通过遗传进化分析鉴定了重组事件的可能性，结果发现2 株PCV2 重组序列，其亲本毒分别为PCV2a 和PCV2b 两种不同基因型。经重组检测软件分析，重组位点均发生在ORF1 区段内，证实重组对PCV2 遗传变异进化的重要性[15]。有学者认为，当猪群自然共感染不同基因型PCV2a 和PCV2b 后，在猪体内发生自然重组表明，自然重组发生在ORF2 基因。该学者已从不同基因型PCV2 共感染猪体中获得重组序列，其亲本毒分别为PCV2a 和PCV2b，基于获得的重组序列，构建重组毒感染性分子克隆，并在体外进行重组毒病毒拯救，获得的重组毒株能适应体外细胞培养[16]。Hesse 等（2008）[17]从临床病料中发现PCV2a 和PCV2b 重组序列，该重组毒ORF1 和ORF2 基因分别来自PCV2a 和PCV2b 两种不同基因型，证实当猪群中有不同基因型PCV2 共同感染时自然重组现象可能会发生。以上所述的PCV2 重组研究的报道，均通过对来自临床样品的PCV2 序列分析所得，没有经体内或体外实验证实。相反，笔者通过不同基因型PCV2a 和PCV2b体外共感染试验首次证实，不同基因型PCV2 体外共感染能发生重组突变体，其重组机率较小，获得重组突变体重组位点位于ORF1 和ORF2 基因连接处及复制原点附近，该发现与上述报道不同。试验进一步表明，重组毒具有很高体外的繁殖能力，与亲本毒呈显著差异。通过体外有限稀释法分离到该重组毒，体外试验表明，重组毒其繁殖效率、抗原性等均发生改变，与亲本毒存在明显差异，而有关重组毒表型的改变是否影响其致病性，尚需研究证实。

3 PCV1 和PCV2 间的重组

传统认为，PCV1 和PCV2 为同科同属成员，结构相似，但二者分别以相互独立的个体形式存在，从属于完全不同的病毒。但最新研究表明，用PCV2 型特异性鉴别荧光定量PCR 方法对临床样品进行检测，由于某检测样品针对的ORF1 和ORF2CT 值不同，偶然发现一变异毒株，经病毒分离及序列分析发现，该变异毒株为PCV1 和PCV2 重组毒，该重组毒ORF1和ORF2 分别来自PCV1 和PCV2a 基因型病毒，按照国际PCV2 命名法则，将ORF1 来源放在前面，ORF2 来源放在后面，因此，新出现的PCV 可以命名为PCV1/2a。全基因核苷酸序列相似性比较发现，该重组毒与PCV1，PCV2a 和PCV2b 基因型的相似性分别为86.4%，88.7%和86.5%。至于该新重组毒的起源尚不明确，其致病性和抗原性有待进一步证实[18]。

4 小结与展望

自2004 年以来，PCV2 成为危害世界范围内养猪业的头号杀手，带来巨大的经济损失。有关PCV2 同种基因型或不同基因型共感染时自然重组的报道日见增多，重组机制及重组毒对猪群的致病性尚无明确报道。当前形势下，应关注PCV 自然重组，因为PCV2 重组毒株的出现为该病毒及引起的相关疾病提出严重挑战。随着PCV2 疫苗的广泛使用，免疫覆盖率越来越大，作为病原而言，其生活环境面临宿主先天性和主动免疫的压力下，病原如何能逃避机体的免疫攻击而在宿主体内存活下来成为病毒遗传进化的驱动力。基于以上研究，推测PCV2 发生自然重组逃避机体免疫监控的机制有：（1）PCV2 通过重组引起其抗原性的改变，导致疫苗免疫抗体丧失或降低对病毒粒子的亲和力。（2）经尚未明确的分子机制，重组杂交后病毒获得较亲本毒更高的繁殖效率，导致机体免疫对大量病毒的中和能力不足。（3）临床上不同基因型PCV2 及重组毒共存，为世界范围内猪圆环病的防治提出警示。至于PCV2 在疫苗免疫的压力下，重组毒是否会成为一种强有力的生存形式值得研究者关注。