人羊膜上皮细胞的神经生物学特性及其对中枢神经系统疾病的治疗作用

任贺田，方 宁，陈代雄

(1.遵义医科大学 研究生院，贵州 遵义 563099;2.遵义医科大学附属医院 贵州省细胞工程重点实验室， 贵州 遵义 563099)

人羊膜上皮组织形成于受精后的第8天，人羊膜上皮细胞(Human amniotic epithelial cells,hAECs)由胚胎上胚层衍化而来。在胚胎阶段，hAECs的功能与神经分化、母胎-免疫耐受及胎儿发育稳态环境有关。从足月分娩的胎盘羊膜提取的hAECs不仅具有多向分化潜能，而且具有免疫调节作用和独特的神经生物学特性，这些特性有助于病损组织和器官的再生和修复[1]。近年来，hAECs的神经生物学特性备受关注，其在神经系统疾病治疗方面具有重要的研究和应用价值。

1 hAECs的神经生物学特性

hAECs具有向神经细胞分化潜能、合成及释放神经递质和神经营养作用，这些神经生物学特性是其修复病损神经组织的重要生物学基础。

1.1 向神经细胞分化潜能 hAECs表达SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、Oct-4、Nanog等干细胞标志，具有多向分化潜能[2-3]。hAECs可分化为神经细胞并表达与神经细胞相关的多种标志物。Sakuragawa等[4]报道培养的hAECs中有超过50%的细胞表达神经元标志物如RC1、A2B5、波形蛋白、神经丝蛋白( NFP)、微管相关蛋白2(MAP2)和MAP2激酶，有20%表达神经胶质细胞标志如胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、环核苷酸磷酸二酯酶、髓鞘碱性蛋白(MBP)和半乳糖脑苷脂。有研究证实，体外培养和诱导的hAECs可以不同比例分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞[5-7]。

1.2 合成及释放神经递质 儿茶酚胺(Catecholamines,CA) 包括多巴胺(Dopamine,DA)、去甲肾上腺素和肾上腺素，它们都是重要的中枢神经递质，许多神经系统退行性疾病与多巴胺能神经通路障碍有关。Elwan等[8]通过体外实验证明，hAECs可自发地分泌CA，在培养基中添加 CA前体物1-酪氨酸和酪氨酸羟化酶辅助因子四氢生物喋呤后，hAECs合成CA明显增加，而通过添加α-甲基-p-酪氨酸抑制酪氨酸羟化酶(TH)的作用则可明显降低CA的产生；进一步检测发现hAECs中含有多巴胺代谢酶。随后，作者进一步证明hAECs可以摄取3，4二羟苯丙氨酸并将其转化为DA[9]。乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)是一种影响神经元和肌肉细胞生理特性的神经递质,由乙酰辅酶A和胆碱通过胆碱乙酰转移酶(ChAT)催化合成。Sakuragawa 等[10]发现hAECs中存在ChAT，并能以时间依赖方式合成、释放ACh。采用实验性妊娠大鼠实验进一步证明，子宫缺氧可促使AEC分泌ACh[11]。这些研究结果提示，hAECs可作为神经退行性疾病细胞治疗的供体细胞。

1.3 神经营养作用 神经营养因子如脑衍生的神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养素-3(NT-3)等对神经元具有营养保护[12]。BDNF可修复突触可塑性，减轻突触损伤，改善认知功能障碍[13]，BDNF减少是AD发生的因素之一[14]。NGF能减轻AD胆碱能神经元损伤，它与基底前脑胆碱能神经元酪氨酸激酶A( TrkA)受体结合后，能促进和维持海马与皮层神经元的突触连接。NGF或BDNF缺乏，或者TrkA或TrkB受体改变，均可导致记忆形成障碍[15]。Uchida等[16]报道，hAECs能合成、释放BDNF、NGF及NT-3。Kakishita等[17]发现无血清hAECs条件培养基可提高酪氨酸羟化酶(TH)阳性DA能神经元的存活，保护其免受6-羟多巴胺(6-OHDA)引起的毒性损伤。hAECs的神经营养作用还涉及DA能神经元的分化和成熟。核受体相关因子1(Nurr1)和垂体同源盒家族因子3(Pitx3)是特异性转录因子，在腹侧中脑DA能神经元发育分化和生存维持过程中起决定作用[18-19]。DA转运体(dopamine transporter,DAT)仅表达于多巴胺能神经元中，能将DA迅速从细胞外转运到突触前神经元胞质内，以维持DA稳态[20]。Yang等[21]报道，用hAECs条件培养基诱导人脐带血间充质干细胞后，DAT、TH、Nurr1和Pitx3表达上调，DA能样神经细胞明显增多。这些研究结果表明，hAECs可通过分泌多种神经营养因子激活神经细胞再生和诱导干细胞向神经元分化。近期Leaw等[22]报道，hAECs可通过释放多种神经营养因子介导小胶质细胞的免疫调节作用，进而减少围产期小鼠脑损伤导致的神经细胞死亡。激活素信号通路在人胚胎神经发育的早期发展中起重要作用。hAECs能合成激活素A和头蛋白(noggin)，前者可直接诱导后者mRNA表达[23]，说明hAECs中存在激活素信号途径，提示在胚胎发育的早期，hAECs对胚胎神经分化起重要支持作用。

2 hAECs对中枢神经系统疾病的治疗作用

2.1 治疗神经退行性疾病 阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)、帕金森病(Parkinson disease，PD)等是常见的神经退行性疾病，其主要临床症状表现为记忆丧失、认知障碍、运动功能障碍和感觉缺失等，目前尚无根本有效的治疗方法。已有资料表明，hAECs移植在治疗神经退行性疾病方面具良好的应用前景。

AD的主要病理特点是脑中β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)积聚，神经元内tau蛋白异常磷酸化形成神经纤维缠结，突触功能丧失等[24]。Xue等[25]报道，将hAECs移植入PPswe/PS1转基因AD模型小鼠侧脑室内，8周后仍可检测到存活的移植细胞，并迁移至第三脑室；行为学水迷宫检测显示，细胞移植组AD模型小鼠空间记忆能力明显改善；高效液相色谱检测发现海马组织ACh水平升高，乙酰胆碱酯酶染色显示海马胆碱能神经元轴突数目增多。炎症和免疫反应是AD发病机制中的重要环节，免疫细胞和免疫因子在AD炎性反应中发挥重要作用[26]。Aβ C端的T细胞表位(Aβ17-21和Aβ29-42 C端)是引起细胞毒作用的核心肽段，可诱导Th1细胞，促进炎症反应。董世桃等[27]报道，脂多糖诱发的AD样病变大鼠海马区移植hAECs后，空间辨别性学习记忆能力明显改善，海马神经元病损减轻，Aβ沉积减少，磷酸化Tau蛋白水平下降，ACh增加；外周血Th1和Th17细胞百分率明显下降，Th2和FoxP3+Treg细胞明显升高，IL-2和IFN-γ水平下调，IL-4上调，提示由hAECs介导的抗炎和免疫调节作用，可能在减轻AD神经组织免疫损伤中发挥重要作用。

PD最显著的病理特点是黑质DA神经元渐进性死亡并伴有纹状体DA合成减少，因此，DA能神经疗法是治疗PD最重要的策略。有研究证实，BDNF、NT-3对DA能神经元具有神经营养支持作用，能改善DA能神经元存活[28]。Kakishita等[29，17]研究证明，常规培养的hAECs中约有10%TH阳性细胞，移植到PD模型大鼠脑内的hAECs可释放DA，并通过分泌神经营养因子阻止DA能神经元的丧失。陈勇等[30]报道，hAECs移植到6-OHDA所致PD模型大鼠前脑内侧束后，黑质TH表达上调，阿朴吗啡诱导的旋转偏位明显改善。从目前的研究结果看，hAECs移植作为治疗PD的DA能神经疗法具有潜在的应用前景。

2.2 治疗多发性硬化 多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)是以中枢神经系统脱髓鞘病变和炎性细胞浸润为特性的自身免疫性疾病，由T淋巴细胞尤其是Th1介导的免疫反应在MS的发病机制中起重要作用[31]。实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)具有与MS相似的行为学改变和病理特征，是普遍用于MS研究的动物模型。Mcdonald等[32]发现EAE小鼠腹腔注射hAECs后，临床症状明显改善，中枢神经系统(CNS)的炎症反应、脱髓鞘和轴突变性明显减轻。郭礼和等[33]报道，EAE小鼠侧脑室或尾静脉注射hAECs 后，动物行为学和CNS病理改变均有明显的改善和减轻。另有研究证明，hAECs对EAE模型的效应机制与其抑制CNS淋巴细胞和巨噬细胞浸润,抑制Th17和Th1细胞应答，抑制促炎细胞因子IL-17的产生，诱导调节性T细胞等抗炎和免疫调节作用有关[34-36]。

2.3 治疗缺血性脑损伤 缺血性脑损伤是一种因脑血管供血不足引起的脑损伤疾病，由缺血缺氧所引发的兴奋性毒性、钙超载、自由基损伤、炎性反应、神经元凋亡等在该病的发生发展过程中发挥重要作用。Okawa等[37]最先报道hAECs治疗成年沙鼠脑缺血损伤，发现hAECs移植入海马后可迁移到海马CA1锥体层,并转化成神经元样细胞和神经干细胞。近期Evans等[38]报道，脑缺血小鼠模型移植hAECs后，脑炎症、梗死发展和功能缺陷明显减轻和缓解；hAECs可通过CXC趋化因子受体4依赖机制向缺血脑组织迁移；早期注射hAECs可有效控制绒猴的脑缺血后梗塞发展。

2.4 对脊髓损伤的修复作用 脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)后发生神经细胞进行性死亡和轴突退化，导致严重的运动、感觉和自主功能障碍，目前尚无有效的治疗方法。Sankar 等[39]报道，灵长类动物脊髓T11-T12完全横断后，将hAECs移植入节段腔内，60 d后受损脊髓节段周围仍有hAECs存活，轴突间相互连接增加；移植后第8周后肢运动功能显著改善，前后肢运动协调能力明显提高，说明hAECs移植能恢复损伤的神经传导通路。另有研究指出，SCI大鼠原位移植hAECs后，能促进轴突的生长，可完全消除脊髓胶质瘢痕的形成[40]。此外，hAECs还能缓解SCI诱导的的机械性痛觉超敏。Roh等[41]报道，大鼠T13脊髓半切损伤13天后，机械性痛觉超敏(MA)和热痛觉过敏(TH)加重；损伤后14 d，将hAECs移植到SCI部位，28天后MA明显减弱，与痛敏感有关的NMDA受体亚单位 NR1磷酸化水平下调，小胶质细胞标志F4/80表达上调，说明hAECs抑制SCI诱导的机械性异常疼痛与其调节NR1磷酸化和小胶质细胞有关。

3 展望

hAECs能分化为神经元、星形胶质细胞，基于这一特性的hAECs替代治疗，有望成为治疗中枢神经系统相关疾病新的途径。其次，hAECs具有神经细胞生化特性，如合成及分泌CA、ACh等神经递质，产生DAT，作为DA能神经疗法的工具，hAECs极具临床应用前景。再有，hAECs可通过分泌多种神经营养因子，为神经细胞提供营养支持，促进神经细胞再生，可广泛用于神经组织损伤的修复。还应强调，hAECs具有免疫豁免特性和免疫调节作用，这不仅有助于移植细胞的定植，而且可抑制因免疫反应过亢所致的病理损伤[42]。

最后，值得提出，hAECs在用于临床之前仍有许多基础性研究有待积累，例如，尽管hAECs植入脑组织后能分化成神经元样细胞，但能否与宿主神经细胞形成新的神经环路，起到恢复神经功能的作用；hAECs在受者体内治疗效应的持续性及其最终命运；hAECs可否因体外扩增发生上皮-间质转化而影响其生物治疗作用；hAECs制备的标准化程序及质控标准，等等，均值得深入探讨。