低强度脉冲超声的生物物理学效应及相关机制的研究进展

郭霜，满江位，姜春倩，李选鹏，王华彬，任小山，韩渊明，王诚，付生军，杨立

1.兰州大学泌尿外科研究所/兰州大学第二医院泌尿外科/甘肃省泌尿系统疾病临床医学中心/甘肃省泌尿系统疾病研究重点实验室，甘肃兰州730030；2.兰州大学第二医院儿科，甘肃兰州730030；3.四川大学华西第二医院病理科，四川成都610041

前言

超声波是指频率在2×104～2×109Hz的机械振动，它可在弹性介质中连续性横向或纵向传播，具有方向性好、穿透能力强、易于获得、能量集中的优点。超声波既是一种波动形式又是一种能量形式（声能）。作为波动，它可以探测负载信号；作为能量，它可以改变媒介的结构和性状［1］。超声作为一种诊断及治疗的工具，现已广泛应用于医学领域，传统上被应用于成像医学，直到1927年才首次发现其具有生物学效应［2］。低强度脉冲超声（Low-Intensity Pulsed Ultrasound,LIPUS）是超声波的一种形式，常用于康复医学治疗，与传统超声相比，其具有低能量强度（＜3 W/cm2）并以脉冲波形式输出的特点。LIPUS作为一种低成本、非侵袭性和安全的生物物理治疗手段，正逐渐应用于临床，用于促进骨折愈合，加速软组织再生和抑制炎症反应等。目前公认的超声波治疗主要通过热效应和非热效应，但其在疾病防治中的具体作用机制尚不明确。本研究主要对LIPUS 的生物物理学效应及其可能的作用机制作一综述。

1 生物物理学效应

超声波的生物物理效应被分为热效应和非热效应，这两个效应是不可分离的，而体外碎石术的机械生物效应仅为非热效应。对于所有其他情况，非热效应总是伴随着一些热效应［3］。然而，不同组织对超声波的吸收能力不同。具有高蛋白质含量和低含水量的组织（如韧带和肌腱）将在更大程度上吸收超声波能量；相反，高含水量和低蛋白质含量（如血液和脂肪）的组织对超声波能量吸收较少［4］。根据组织对能量吸收程度进行排名，能量吸收最高的为软骨和骨骼，其次为肌腱、皮肤、肌肉、神经、脂肪和血液［5］。组织吸收超声波能量是发挥其生物物理学效应的基础，只有超声波能量更好地被组织吸收才能更好地发挥其生物物理效应。

1.1 热效应

当超声波穿过组织时，其一部分会被吸收，导致在该组织内产生热量。吸收热量的大小取决于组织的性质、血管化程度及超声波使用的频率。具有高蛋白质含量的组织更容易吸收超声波，然而其温度也不会一直升高，因为体内存在的稳态机制将趋向于抵消组织的温度上升。任何温度变化都将自动启动稳态调控机制，温度动态平衡调节的成功与否主要取决于热增加和热损失之间的平衡。如果组织的温度升高到40～45 ℃，则可以实现至少5 min的显著热效应。因此，控制组织加热温度保持在适当水平是非常重要的。对于LIPUS而言，由其低强度脉冲输出模式而产生的热效应是相当小的，甚至可以忽略不计。

1.2 非热效应

LIPUS的热效应非常小，发挥作用主要依靠其非热效应，因此诱导组织变化的非热效应是大多数研究关注的重点。非热效应分为空化效应和其他机械效应。

1.2.1 空化效应 通常的术语“空化”可用于描述任何气泡现象，但在超声中将用于表示声空化，即声场内气泡的行为。超声波空化作用是指存在于液体中的微气核空化泡在声波作用下振动，当声压达到一定值时发生的生长和崩溃的动力学过程。空化是超声波在组织或液体内形成气体填充空隙的能力，具有两种形式，即稳定的空化和不稳定的空化。稳定的空化发生在治疗能量级别的超声波，气泡经过1 000个循环以达到其最大尺寸，主要应用在强化药物输送和治疗领域［6］；而不稳定的空化通常发生在具有非常高强度（≥1 000 W/cm2）的聚焦超声，可以产生瞬间组织坏死，气泡崩溃迅速释放大量能量［7］，主要应用于癌症消融和姑息治疗。保持稳定的空化才能更好地发挥其治疗作用。

1.2.2 其他机械效应（1）声流。声流是振动气泡周围流体中局部液体的流动。由于宏流的机械能力远不如微流强，因此正确区分宏流和微流尤为重要。宏流是当超声波在液体中传播，并且流体沿单个方向移动时发生的大量流动；微流是与振荡源相邻的涡流，属于微小的流动。微流与空化相关并且在空化中继发出现，微流具有足够强度以改变膜渗透性，并在细胞膜和组织液边界发生时刺激细胞活性的唯一类型的声流［3］，其可以影响扩散速率和膜通透性，可改变蛋白质合成和细胞分泌过程［5］。稳定的空化和声流对LIPUS应用其非热效应尤其重要。

（2）传质强化。超声波通过促进质量转移和反应速率来提高液体介质的运动，这也发生在用LIPUS处理的细胞和靶组织中。一般来说，传质强化主要发生在3个领域：细胞膜、胞质溶胶和边界层。通过振动气泡产生声场周围的微流，将试剂引导到酶的活性位点或细胞，同时生物制品被释放到发生生物效应的介质中［8］。传质强化是LIPUS发挥其非热效应的重要组成部分。

2 LIPUS设备参数

目前，治疗超声设备工作频率通常为1或3 MHz，而LIPUS设备工作频率通常为1.5 MHz，某些设备还提供了0.75 MHz的选择，可对更深的病变部位有效［7,9］，已有1.7 MHz频率的LIPUS用于改善大鼠糖尿病勃起功能障碍（Erectie Disfunction,ED）模型的阴茎勃起功能，并有望成为治疗ED的一种新方法［1］，其他频率是否有效还有待进一步验证。目前常用的脉冲超声波设备通常以1：4的1 000 Hz脉冲发送超声波，即200 μs超声波作用时间和800 μs间歇时间，每秒1 000次循环。根据暴露强度，治疗超声可分为低强度超声（＜3 W/cm2）和高强度超声（≥3 W/cm2）。低强度超声的剂量可进一步分为低剂量（＜1 W/cm2）、中剂量（1～2 W/cm2）和高剂量（2～3 W/cm2）。在临床应用中，施加的超声强度范围为0.03～1.00 W/cm2［7］。多数研究中的LIPUS都使用30 mW/cm2强度声波，1 000 Hz的脉冲比率为1：4，频率为1.5 MHz［10］。

3 分子生物学机制

3.1 LIPUS相关的信号传导通路

3.1.1 细胞增殖相关传导通路 2004年，Zhou等［11］通过LIPUS对原代人包皮成纤维细胞增殖的影响研究发现，LIPUS能通过激活整合素受体和Rho/ROCK/Src/ERK信号通路以促进细胞增殖。LIPUS也可促进软骨细胞增殖，降低软骨细胞的凋亡率［12］。Ryohei等［13］研究LIPUS对软骨细胞增殖的影响，发现LIPUS通过促进整合素/磷脂酰肌醇3-OH激酶/Akt通路信号转导与细胞增殖相关而不是通过整合素/MAPK通路转导，然而其机制是复杂的，不同通路之间可能有些部分是相通的。未来对其机制的研究还需进一步完善。

3.1.2 细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）相关传导通路 ECM在维持器官和组织正常的形态和功能中是非常重要的。有研究发现LIPUS对正常软骨细胞可以通过调节整合素/FAK/PI3K/Akt通路以促进ECM的生成［14］。Cheng等［15］研究发现整合素FAK-PI3K/Akt通路在骨性关节炎的病理过程中起着重要作用，并且发现LIPUS对骨性关节炎的软骨细胞的保护作用是由整合素-FAK-PI3K/Akt信号通路介导。Zhang等［16］研究LIPUS对人退变髓核细胞的ECM合成的影响，将细胞暴露于平均时间强度为30 mW/cm2，频率为1.5 MHz的LIPUS，20 min/d，持续1周。结果发现，与对照组相比，LIPUS治疗组显著上调了聚集蛋白聚糖、胶原蛋白II、Sox9和金属蛋白酶组织抑制因子的表达，并抑制了基质金属蛋白酶-3的分泌。该研究进一步证实LIPUS可通过激活FAK/PI3K/Akt通路，使聚集蛋白聚糖，胶原蛋白II和Sox9的表达上调，进一步促进人退变髓核细胞ECM的合成。张晓军等［17］也发现LIPUS能通过PI3K/Akt信号途径促进立体培养的人退变髓核细胞合成ECM。LIPUS可以减轻关节软骨ECM的损伤程度，其作用与LIPUS治疗后关节软骨中p38和ERK1/2表达下调有关［18］。夏鹏等［19］发现LIPUS体外辐射可抑制OA软骨细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖降解及MMP-13表达，同时还能促进整合素Bl表达及FAK磷酸化，抑制p38、ERKl/2、JNK磷酸化，提示LIPUS可能通过启动整合素-FAK-MAPK-信号转导通路诱导软骨ECM发生改变。通过对ECM相关机制的深入探讨，丰富了LIPUS在治疗方面的机制研究，并为LIPUS更好地应用于临床提供理论依据。

3.1.3 干细胞/祖细胞系的多向分化相关传导通路Kusuyama等［20］将LIPUS应用于脂肪生成的祖细胞和间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell,MSC）系，分析细胞分化如何受影响。研究发现，LIPUS抑制了两种细胞类型的脂肪形成和分化，其脂滴出现受损表现；LIPUS通过诱导Runt相关转录因子2（Runx2）和骨钙素的表达，将MSC分化为成骨细胞；LIPUS可以诱导Osaka甲状腺致癌基因磷酸化/肿瘤进展位点2（Cot/Tpl2）激酶的磷酸化表达，增强MEK1和p44/p42胞外信号通路的磷酸化过程，并调节ERK表达。因此，LIPUS可能通过Rho相关激酶Cot/Tpl2-MEK-ERK的信号通路抑制脂肪形成并促进MSC的成骨。Xia等［21］研究也发现LIPUS能促进TGF-β1诱导的骨髓MSC软骨形成，并使COL2、aggrecan和SOX9基因表达增加，降低COL1的表达，然而添加整合素和mTOR抑制剂后，这些作用消失。因此得出结论：LIPUS能通过整合素-mTOR信号传导途径促进TGF-β1诱导的骨髓MSC软骨形成。

3.1.4 其他相关传导通路 Xue等［22］通过在大鼠正畸牙运动模型中的研究发现，LIPUS能通过刺激HGF/Runx2/BMP-2信号通路和增加NF-kB配体的受体激活剂的表达来促进牙槽骨重塑，且LIPUS能通过Runx2调节增加BMP-2表达。王飞等［23］发现LIPUS在牙本质损伤修复早期可上调TGF-β1和Smad2，3的表达，提示TGF-β1/Smad2，3信号通路可能参与了牙本质损伤的修复过程。

FBXL2介导的TRAF6泛素化和降解在无菌性炎症性假体周围松动过程中起重要作用。Zhao等［24］发现LIPUS能诱导FBXL2的表达，抑制TRAF6的功能，并最终防止无菌性炎症性假体周围松动。

对糖尿病ED大鼠动物模型进行研究发现，经声波固有频率1.7 MHz、脉冲频率1 kHz和输出间歇比为1：4的LIPUS治疗后，糖尿病ED大鼠阴茎海绵体内的压力和阴茎海绵体组织病理变化明显改善，阴茎海绵体内纤维化相关信号通路转化生长因子-B/Smad蛋白表达下调，内皮型一氧化氮合酶和神经元型一氧化氮合酶表达明显升高［1］。有研究还发现，LIPUS改善ED患者的症状与阴茎组织中TGF-β1/Smad/CTGF信号通路的下调相关［25］。

总之，LIPUS发挥其作用与细胞增殖、ECM和干细胞/祖细胞系的多向分化等相关传导通路有关，其机制是多方面的，然而在不同的细胞或组织，其发挥的生理作用可能不尽相同，并且其机制探讨缺乏更多的动物实验及临床试验的验证，详细具体的机制还需要进一步探讨。

3.2 LIPUS影响的潜在基因

Tabuchi等［26］通过微阵列分析发现，细胞经LIPUS处理后，有38个基因上调2倍，37个基因下调1.5倍以上；其中17个基因通过实时定量PCR检测验证，与微阵列数据一致。在75个基因中，Mmp13和Dmp1表示与LIPUS有关。LIPUS（30 mW/cm2，20 min/d）显著增加了第10 天MC3T3-E1 细胞培养物中和第3 天的髓核HNPSV-1细胞培养物中Mmp13 mRNA的表达。然而，也有研究显示，LIPUS（30 mW/cm2）治疗组和对照组在对体外培养的牙本质-牙髓复合物的Dmp1表达上没有统计学差异［27］，因此还需要更多研究进一步验证。包含属于螺旋-环-螺旋（HLH）转录因子的Id1、Id2和Id3的分化抑制剂（Id）基因可以在基本的HLH转录因子中形成异源二聚体，这些基因可能参与LIPUS诱导的组织愈合的加速［8］。Kobayashi等［28］应用cDNA芯片来评估体外受LIPUS影响的基因。cDNA微阵列结果证实，LIPUS显著刺激生长因子的表达，包括BMP2、FGF7、TGFβR1、EGFRF1 和血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）及其受体。Lü等［29］发现LIPUS增强了雪旺细胞特异性标志物（S100b和GFAP）的基因和蛋白表达水平。LIPUS影响的潜在基因比较广泛，还需要更多的研究完善LIPUS潜在基因的影响。

3.3 LIPUS通过VEGF促进血管生成

超声具有刺激血管生成因子的作用，能促进IL-8、bFGF和VEGF的生成。VEGF是特别有效的血管生成因子，超声处理成纤维细胞、单核细胞和成骨细胞这3种细胞类型时，VEGF都显著增强。LIPUS可增加NO合成酶的活性，提高NO水平，促进VEGF-A基因表达，从而有利于血管内皮细胞的生成，促进血管再生［30］。Hanawa等［31］评估VEGF在人脐静脉内皮细胞中的表达，证实LIPUS在培养的人内皮细胞中会显著上调VEGF的mRNA表达。他们还研究了LIPUS在左心室射血分数降低的慢性心肌缺血猪模型中的体内作用，结果表明，与对照组相比，LIPUS实验组缺血区域毛细血管密度明显升高，心肌血流量显著增加，并且仅在LIPUS组中发现VEGF、内皮型一氧化氮合酶和bFGF均显著上调。Ogata等［32］也发现LIPUS能通过增强心肌血管生成和减轻血管周围纤维化来改善长期压力超负荷心脏的收缩功能障碍，LIPUS可能是治疗慢性压力超负荷引起的心脏功能障碍的非侵入性治疗手段。LIPUS在心血管疾病中可能具有较大的潜力，需更多临床试验以进一步验证。

3.4 LIPUS对干细胞体外分化的影响

Lü等［29］研究LIPUS对诱导多能干细胞-衍生神经嵴干细胞（Induce Pluripotent Stem Cells-Derived Neural Crest Stem Cells,iPSCs-NCSCs）的细胞增殖、细胞活力和分化的影响，发现LIPUS（500 mW/cm2）增强了iPSCs-NCSCs治疗两天后的生存力和增殖能力，并上调了iPSCs-NCSCs中GFAP、S100β、Tuj1和NF-M的表达。LIPUS治疗后7天，只有GFAP、NF-M和S100β上调。LIPUS可能是一种经济而有效的方法来增强体外细胞增殖、细胞活力和神经分化。通过LIPUS和iPSCs-NCSCs修复大鼠横断坐骨神经模型研究发现，每天应用LIPUS（0.3W/cm2）5 min，共治疗两周可显著改善坐骨神经功能指数，而组织学分析也显示出新的血管和新的神经丝，在LIPUS实验组中刺激iPSCs-NCSCs发现β-III微管蛋白（Tuj1）的表达较高［33］。综上所述，LIPUS可能为周围神经组织损伤的治疗提供新的思路。

3.5 LIPUS相关的抗炎作用

3.5.1 TLR4相关的抗炎作用 Nakao等［34］研究LIPUS如何影响脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导的成骨细胞的炎症反应，结果发现，LPS在小鼠成骨细胞系和颅骨源性成骨细胞中迅速诱导包括CCL2、CXCL1 和CXCL10在内的几种趋化因子的mRNA表达；LIPUS治疗显著抑制LPS诱导CXCL1和CXCL10的mRNA表达，LIPUS 处理的成骨细胞中ERKs、p38 激酶、MEK1/2、MKK3/6、IKKs、TBK1和Akt的磷酸化水平降低。此外，LIPUS通过LPS抑制NF-κB应答元件和干扰素敏感应答元件的转录激活。在瞬时转染实验中，LIPUS会显著抑制TLR4-MyD88复合物的形成。因此，LIPUS可通过抑制TLR4信号转导，对LPS诱导的成骨细胞发挥抗炎作用。

3.5.2 COX-2 相关的抗炎作用 Iwabuchi 等［35］研究LIPUS 对环氧合酶-2（COX-2）表达及相关机制的影响发现，用IL-1β处理源自猪下颌髁培养的关节软骨细胞后，COX-2的mRNA水平上调，应用LIPUS会显著抑制COX-2 的mRNA 表达（P＜0.01）。并且发现LIPUS 是通过整合素β1 受体及随后ERK1/2 的磷酸化来抑制IL-1β 诱导的COX-2 表达。据报道，LIPUS处理MRL/lpr 小鼠所引起的组织学损伤显著较低。经LIPUS 处理的动物中，COX-2 阳性细胞也显著降低［36］。因此，LIPUS治疗可能是炎症性疾病的有效治疗方法。

4 结论与展望

LIPUS作为一种低成本、非侵袭性、安全的生物物理治疗手段，主要通过其非热效应发挥作用。LIPUS相应的分子生物学机制主要表现在与其相关的信号传导通路、基因表达、血管生成和干细胞分化等，然而其作用机制仍不是十分明确，因此，人们对于LIPUS的认识还需进一步深化，对于其相关的基础研究还需进一步深入，对于其临床应用的探索还需更加规范，对于其疗效还需进一步验证。相信随着对LIPUS相关的生物学机制和临床研究的不断深入，LIPUS将会得到更加广泛的应用，并有望成为防治疾病的新方法。