双酚A及其类似物对哺乳动物和鱼类神经毒性效应及机制研究进展❋

王 蔚， 王子豪， 张晓娜

(中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛 266003)

双酚类化合物是生产聚碳酸酯塑料和环氧树脂的主要成分，生产量大且应用广泛，目前在河流、沉积物、土壤等环境介质和人体内均已经能检出[1-4]。越来越多的研究表明，环境中的双酚类化合物污染与神经发育障碍疾病的发病密切相关[5-7]。双酚类化合物对人、哺乳动物和鱼类等均具有明显的神经毒性，能够影响社会行为、焦虑水平、神经功能及神经递质含量等[6-16]。

因此，本研究综述了双酚类化合物对哺乳动物和鱼类的神经毒性效应及作用机制的研究进展。

1 双酚类化合物污染现状

双酚类化合物是指一类具有2个羟苯基结构的化学物质，包括双酚A(Bisphenol A，BPA)、双酚AF(Bisphenol AF，BPAF)、双酚S(Bisphenol S，BPS)、双酚F(Bisphenol F，BPF)、双酚B(Bisphenol B，BPB)、双酚E(Bisphenol E，BPE)、四溴双酚A(Tetrabromobisphenol A，TBBPA)等。在生产和使用过程中，双酚类物质会从塑料或者纸制品中渗出，污染环境并危害着人体健康。

近年来，双酚类化合物在塑料、纸制品等日用品中频繁检出，例如，李璐等[17]在化妆品的塑料包装中检出了ng/g级别的BPA；Liao等[2]在热收据、纸币及传单等16种纸制品中检出BPS的平均浓度为0.181 mg/g。当塑料制品不完全聚合或暴露于高温、碱性等环境中时，双酚类化合物就会释放或溶出，进入食物或环境中[18]。在中国九个城市中的289个食品样品中，检出BPA的平均浓度为4.94 ng/g和BPF平均浓度为2.50 ng/g[19]。另外，Jin等[20]对台湾16条河流进行调查发现，河水中BPA的浓度为0.01～44.65 μg/L、沉积物中BPA的浓度为0.37～491.54 μg/kg干重。随着BPA的限用及其替代物使用范围的扩大，BPF、BPS等BPA类似物近年来在污泥及水体中的检出率也越来越高，其浓度与BPA相近甚至更高，例如，中国30个城市的污泥样本中，BPS与BPF的浓度分别为3.02、3.84 ng/g，与BPA(4.69 ng/g)相近[1]；而在我国珠江水样中检出BPF的浓度则高于BPA[21]。

环境中广泛存在的这些双酚类化合物可通过接触、饮食及水体暴露等方式进入人体内。2003—2004年间的2517例美国人血液样本中，BPA的检出率为92.6%，平均浓度为2.6 ng/mL[3]，这与陈默等[22]对40例北京女性尿液样本进行的调查结果相近。Yang等[23]在94例来自我国不同省份的尿液样本中检测到了BPA及其类似物BPS、BPF和BPAF，这些类似物的检出率虽低于BPA，但检出浓度却与BPA相近。

2 双酚类化合物的神经毒性效应

近年来，流行病学研究发现，环境中的双酚类物质与自闭症谱系障碍(Autism Spectrum Disorder，ASD)和精神分裂症等神经发育障碍疾病的发病存在着相关关系[5-7]，因而双酚类化合物的神经毒性备受研究者关注。一般来讲，外源化学物质的神经毒性效应指引起动物体神经系统结构和功能损伤的能力，主要表现为神经细胞发育受损和凋亡异常、行为异常、神经递质含量变化及动物体电生理特性的改变等。

2.1 BPA及其类似物对神经细胞发育的影响

神经细胞为构成神经系统结构和功能的基本单位，由细胞体和细胞突起构成。细胞体一般存在于脑、脊髓和神经节中；细胞突起(包括树突和轴突)则是由细胞体延伸出来的细长部分，可延伸至全身各器官和组织，负责传递兴奋。突触结构损伤或发育异常会直接影响动物的行为和学习记忆能力，如发育过程中小鼠重复行为(ASD相关行为表型)的增加与脑中树突棘数量的减少有关[24]；孤独症模型大鼠中也发现兴奋性突触增多和抑制性突触减少的现象[25]。研究表明，BPA能够破坏轴突生长、影响神经细胞发育，如Wang等[26]报道15 μmol/L BPA暴露破坏了斑马鱼胚胎中初级和次级运动神经元的轴突生长。但也有体外实验证实，BPA能够加速轴突/树突的生长和发育，如10～1 000 nmol/L BPA显著增加了大鼠海马神经细胞树突丝的运动性和密度及磷酸化谷氨酸NMDA受体NR2B(调节神经元的树突、轴突结构发育)的表达量[27]；Huang等[28]发现较低浓度(1～100 nmol/L)BPA暴露也能够促进大鼠下丘脑细胞中树突和轴突的发育。然而，关于BPA类似物对神经细胞突触发育影响的研究目前尚未见报道。

神经细胞发育过程中，神经细胞的异常凋亡或分化过程异常也会直接影响神经细胞的数目和神经系统的正常生理功能。BPA已被证实能够通过诱导神经细胞凋亡或抑制其分化，进而影响神经系统发育。例如，BPA暴露妊娠期大鼠，会导致子代雄性大鼠(5和50 mg·kg-1·d-1BPA暴露组)脑中DA能神经元的异常凋亡[29]。此外，BPA的暴露还能够抑制DA能神经细胞的分化，进而影响DA能神经系统发育[30]。研究发现，BPA的替代物也具有类似的神经毒性效应，如BPAF的暴露能诱导小鼠海马神经元细胞(HT-22)和小鼠原代神经元细胞的异常凋亡[31]。

2.2 BPA及其类似物对动物运动能力及社会行为的影响

双酚类化合物的神经毒性还表现在对动物体运动能力的影响上。有研究发现BPA及其类似物能够抑制鱼类的运动能力，如1、5和15 μmol/L BPA自受精后6 h(hours post fertilization 6 hpf)暴露斑马鱼至96 hpf，能显著降低受精后5 d(5 days post fertilization，5 dpf)幼鱼的平均游泳速度和触摸反应[26]；白承连等[32]报道，TBBPA暴露也能抑制斑马鱼幼鱼的运动行为。然而，低剂量的BPA及其类似物却能诱导斑马鱼多动，例如Saili等[33]报道0.01、0.1和1 μmol/L BPA暴露导致斑马鱼幼鱼自发运动的时间显著增加；极低剂量(0.006 8 μmol/L)的BPA及其替代物BPS暴露也能诱导5 dpf斑马鱼幼鱼多动[34]。

除运动能力外，双酚类化合物还能够影响动物的社会行为[5-6]。例如，Weber等[35]报道0.1和1 μmol/L BPA暴露斑马鱼幼鱼(6～120 hpf)，经清水恢复后的成年雄性斑马鱼的社会互动行为受到明显抑制，但其对镜面中鱼体的攻击性明显增强。此外，目前研究发现BPA替代物也能导致动物社会行为异常、学习记忆能力受损。例如，BPF和BPS暴露青春期小鼠会导致其成年后发生抑郁行为[11]；500 μg/L BPAF也能损伤斑马鱼的学习记忆能力[36]。

2.3 BPA及其类似物对神经递质含量的影响

中枢神经递质主要分为胆碱类、单胺类、氨基酸类、肽类等，对调节动物体的运动行为具有重要作用，而双酚类化合物能够通过影响神经递质含量而发挥神经毒性。很多研究报道，BPA能扰乱5-羟色胺(5-Hydroxytryptamine，5-HT)、去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)、肾上腺素(Epinephrine，E)和多巴胺(Dopamine，DA)等单胺类神经递质水平[37]。例如，4、40和400 mg·kg-1·d-1。BPA暴露雌性大鼠，能够显著升高其子代脑中5-HT和NE的含量[38]。由于单胺类神经递质在调控情绪、运动和情感行为等过程中发挥着重要的作用[39-40]，因此双酚类化合物暴露所导致的神经递质水平紊乱是其造成动物认知能力和行为异常的主要原因之一。Manar等[41]发现BPA(250 mg·kg-1·d-1)暴露显著降低成年大鼠海马中DA、NE和5-HT含量，进而造成其认知功能缺陷。然而，低剂量(250 ng·kg-1·d-1)BPA暴露则能显著升高雄性小鼠脑中DA含量，诱导其产生焦虑行为[8]。目前有关BPA类似物对神经递质含量的影响研究还较少，如Ye等[42]研究已证实，TBBPA能显著上调海洋疟原虫胚胎和子代个体中的DA水平，但尚未见深入报道。

除单胺类递质外，双酚类化合物也能影响氨基酸类神经递质的含量。Ogi等[43]报道低剂量(500 μg·kg-1·d-1)BPA暴露发育期小鼠，导致成年后雌性小鼠脑中γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)和谷氨酸(Glutamate，Glu)水平升高，而成年雄性小鼠脑中GABA水平降低、Glu水平升高。不同于单胺类和氨基酸类神经递质，由于肽类和其他类神经递质种类及功能的多样性，目前关于双酚类化合物对肽类及其他神经递质影响相关的研究还较少。

2.4 BPA及其类似物对动物体电生理特性的影响

生物的器官、组织和细胞在生命活动过程中会发生有规律的电位和极性的变化，称为生物电，生物电信号包括静息电位和动作电位，其中动作电位的产生和传播是神经冲动传导的本质，介导着动物体的各种生理活动[44]。通过改变动作电位进而影响动物体的正常生理活动，也是双酚类化合物神经毒性的一种表现。研究报道，BPA(0.1～100 μmol/L)能剂量依赖性地抑制大鼠背根神经节神经元的钙电流及细胞膜去极化过程，进而显著降低胞内钙浓度升高的幅度[45]。此外，还有研究发现低浓度(1、10、100 nmol/L)BPA能够促进大鼠海马神经元中Glu所诱导的胞内Ca2+水平增加，而1 000 nmol/L BPA则表现出明显的抑制作用[46]。但关于BPA类似物对神经细胞电生理特性影响的研究目前尚未见报道。

3 双酚类化合物发挥神经毒性效应的作用机制

3.1 干扰神经细胞发育、调亡与分化

双酚类化合物可通过影响神经细胞发育、诱导神经细胞凋亡、抑制神经细胞分化等多种途径，干扰神经系统的正常发育。因与雌激素具有结构相似性，BPA及其类似物均可能通过雌激素受体(Estrogen receptor，ER)介导途径，干扰神经系统发育进而导致动物体行为异常。如，BPA和BPS均可通过ER途径，显著增加斑马鱼幼鱼下丘脑中GnRH3神经元的数量[47]；Iwakura等[28]的研究发现，BPA能通过上调突触前蛋白1和微管相关蛋白2的活性，加速大鼠下丘脑细胞树突和轴突的发育，该促进作用可在一定程度上被雌激素受体拮抗剂所阻断。除ER途径外，研究发现BPA还能通过靶点Wnt7a基因降低β-catenin蛋白的稳定性并损伤树突棘的形成和生长，进而损害SD鼠的空间记忆能力[48]。

除神经细胞的发育外，神经细胞的凋亡在神经系统的正常发育过程中也起着至关重要的作用，而ER途径也是双酚类化合物诱导神经细胞凋亡的主要机制之一[49]。BPA及其类似物还可通过作用于细胞外信号调节激酶(Extracellular regulated protein kinases，ERK)和丝裂原活化蛋白激酶(Caspase 3)等途径，诱导神经细胞凋亡。Lee等[50]报道BPA能够激活ERK、抑制抗凋亡核因子kappa B的活化，进而诱导小鼠神经细胞凋亡。BPA与BPAF均能够诱导Caspase 3活化、改变胞内钙离子浓度、产生过量的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，诱导神经细胞凋亡[31,51]。近年研究证实双酚类化合物还能抑制神经细胞的分化，如Huang等[30]报道BPA能通过下调人胚胎干细胞中胰岛素样生长因子1基因的表达，显著抑制DA能神经细胞的分化，进而影响DA能神经系统的发育过程。

3.2 干扰神经递质的储存和释放，影响神经递质的代谢

神经递质通常合成于神经元末梢，合成后贮存于囊泡内，当神经冲动到来时，神经末梢内的递质自突触前膜释放入突触间隙，作用于突触后膜的受体，引起突触后膜离子通透性改变以及电位变化，进而调控运动行为等生理过程。发挥功能后，部分递质被降解酶水解而失去活性，另一部分在递质转运体的作用下被突触前膜或后膜重摄取，还有少量递质会进入血液循环而被酶促降解[52]。目前的研究证实，双酚类化合物可通过干扰神经递质的储存、释放和代谢等过程影响递质含量。Nowicki等[53]报道BPA(0.1～400 μmol/L)暴露显著增强了SH-SY5Y细胞(人神经母细胞瘤细胞系)摄取DA的能力，但抑制了GH3细胞(大鼠垂体细胞系)对DA的摄取。此外，BPA(0～150 μmol/L)还能通过选择性N型钙通道或激活蛋白激酶A等途径，诱导PC12细胞(鼠肾上腺嗜铬细胞瘤)释放DA[54]。除改变细胞摄取和释放神经递质的能力外，BPA及其类似物还能干扰DA、5-HT、乙酰胆碱等递质的代谢过程。例如，1 μmol/L BPA显著降低DA能神经元中酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)的活性，减少DA的合成[30]。然而，更低剂量的BPA暴露小鼠对DA代谢的影响机制却不同，如250 ng·kg-1·d-1BPA暴露妊娠期小鼠，可降低单胺氧化酶B(Monoamine oxidase B，MAO-B)的活性，导致幼年和成年雄性小鼠部分脑区DA水平升高[8]。Shingo等[12]报道250 ng·kg-1·d-1BPA显著上调了子代雌性小鼠脑中5-HT合成、转运和降解基因mRNA的表达水平，干扰了其代谢活性。目前的研究发现部分BPA类似物也能影响DA和5-HT的代谢，如Beatriz等[55]报道BPF和BPS(10 μg·kg-1·d-1)能显著降低发育期大鼠脑中TPH(5-HT合成)、TH(DA合成)、MAO-A和MAO-B(降解)基因的表达量。

除单胺类神经递质外，BPA还能通过干扰胆碱类、氨基酸类递质的代谢酶活性/基因表达量，进而干扰其代谢过程。例如BPA(50 μg·kg-1·d-1)降低了雄性大鼠海马中乙酰胆碱酯酶的活性，导致大鼠空间记忆能力受损[56]。Zhou等[57]发现BPA(40 μg·kg-1·d-1)暴露妊娠和哺乳期雌性大鼠，能显著降低子代雌鼠脑中谷氨酸脱羧酶67(GABA的合成酶)基因的表达水平。然而，目前有关BPA替代物对这些神经递质的影响及机制研究还鲜有报道。

3.3 干扰神经递质受体表达

如前所述，神经元释放的神经递质作用于突触后膜的受体后可引起突触后膜产生兴奋性或抑制性突触后电位，进而发挥生物学效应。双酚类化合物可通过干扰5-HT、DA、GABA及Glu等递质受体的表达，影响递质功能发挥，进而导致动物体学习记忆能力受损和行为异常。例如，BPA(40 μg·kg-1·d-1)暴露妊娠和哺乳期大鼠，显著降低子代大鼠海马中谷氨酸(mGlu2/3)受体蛋白及mRNA表达量[58]；Shingo等[12]报道低剂量BPA(250 ng·kg-1·d-1)暴露增加了幼年雌性小鼠延髓5-HT受体(Htr1a)和中脑Htr2a mRNA水平、降低了纹状体中Htr2c mRNA水平，导致其恐惧记忆力增强；Xu等[59]的研究表明，BPA(0.4、4、40 mg·kg-1·d-1)显著降低了成年雄性小鼠海马中GABA(A)α2受体蛋的水平，并导致其易出现焦虑和抑郁，而同浓度BPA对雌性个体的影响则完全相反。此外，BPA类似物如BPF和BPS(10 μg·kg-1·d-1)也能改变子代雌性幼鼠脑中DA和5-HT受体和代谢相关基因的表达量[55]。

3.4 其它作用机制

除上述作用机制外，双酚类化合物还能直接作用于神经系统，影响下丘脑GnRH神经元的正常功能。体外实验表明，50 μmol/L BPA可通过G蛋白偶联受体和雌激素受体等途径，显著降低GnRH神经元钙振荡的频率，进而抑制GnRH神经元活性；而阻断GABA和Glu的能量输入并未消除BPA的抑制作用，进一步证实了BPA能够直接影响GnRH神经元[60]。

此外，BPA暴露还能改变神经细胞内外Ca2+水平，影响动作电位的产生和传播过程，进而产生神经毒性。例如，BPA(0.1、1、10、100 μmol/L)暴露抑制Ca2+通道，进而以剂量依赖性的方式抑制大鼠背根神经节神经元的钙电流[45]；另有研究报道，BPA能通过作用于ERK1/2和丝裂原活化蛋白激酶p38 MAPK信号通路，促进大鼠海马神经元中Glu所诱导的胞内Ca2+水平的增加[46]。

综上所述，国内外学者对BPA的神经毒性效应及机制进行了大量研究，然而目前有关BPA类似物的神经毒性效应研究却相对较少，其作用机制也有待深入探究。BPS、BPF、BPAF等双酚类物质近年来已广泛应用于日常生活用品的生产，其环境检出率虽较BPA更低，但检出浓度却可能与BPA相当，目前关于低剂量双酚类化合物神经毒性效应的证据仍不充分，需要开展大量研究揭示环境剂量水平BPA及其类似物的神经毒性效应及潜在作用机制。今后可从以下方面入手，完善双酚类化合物的神经毒性数据，为环境和健康风险评价及决策制定提供理论依据。

4 研究展望

4.1 双酚A类似物的神经毒性效应研究

鉴于BPA广泛的生物毒性[61-62]，近年来其替代品BPS、BPF、BPAF等的生产和应用逐渐增多，且BPS等类似物已大量应用于婴幼儿制品中。目前已经有研究者开始关注这些BPA类似物对动物行为、神经细胞发育和凋亡以及神经递质含量等的影响[63]，但关于BPA类似物对神经细胞凋亡影响的研究多集中于体外实验[31]，其对神经细胞突触发育影响也尚不明确。另外，虽然已有研究报道了BPF、BPS等BPA类似物能够改变DA、5-HT受体基因和代谢相关基因的表达量[55]，但这些双酚类化合物对单胺类、胆碱类及氨基酸类神经递质含量影响的相关研究尚未见报道。因此，今后需结合体内和体外实验，从神经细胞发育及神经递质含量等角度，研究BPA类似物的神经毒性效应，为这些BPA类似物的安全性评价提供更多的毒理学数据支撑。

4.2 双酚类化合物通过发挥雌激素效应进而产生神经毒性的作用机制研究

流行病学研究和临床实验均发现雌激素有助于提高认知能力、雌激素替代治疗对一些神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病有较好的治疗效果，并且脑组织本身也会在损伤部位上调雌激素的合成量和雌激素受体表达，说明雌激素对神经系统具有一定的保护作用[64]。Wooten等[65]分析全球统计资料发现，男性患帕金森病的风险明显高于女性，作者认为这种性别差异现象，可能与雌激素对神经系统的保护作用相关。很多动物实验也证实，某些神经系统疾病的发生存在性别差异与雌激素的神经保护作用有关，如Dean等[66]的研究报道经1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP，一种选择性破坏DA神经元的神经毒素)处理后，雄鼠纹状体中DA含量明显低于雌鼠，更易发生运动紊乱进而发展成为帕金森病，而雌激素处理能够缓解此现象。目前的研究证实，大多数双酚类化合物都具有弱雌激素活性[67]，并且能够干扰内源雌激素的合成。值得注意的是，双酚类化合物对动物体的神经毒性效应也存在明显的性别差异，如低剂量BPA能够干扰幼年和成年雄性小鼠脑中DA水平并诱导其产生焦虑行为，但对雌性小鼠却没有影响[8]；0.1、1 μmol/L的BPA暴露能抑制成年雄性斑马鱼的社会互动行为，但对雌性个体无明显影响[35]。因此，今后可从雌激素效应角度进一步探究BPA及其类似物导致这种具有性别差异的神经毒性效应的潜在机制。

4.3 低剂量双酚类化合物的神经毒性作用机制研究

目前环境中检出的双酚类化合物浓度一般较低[1,17,19,21]，欧洲食品安全局(EFSA)的最新规定中，人体BPA的每日允许摄入量为4 μg·kg-1·d-1[68]，综合大范围全球尿浓度数据(2000—2016年)进而估算全球每人每日双酚A(BPA)摄入量，发现大多低于此标准[69]。然而，很多研究证实低剂量的双酚类化合物即能产生明显的神经毒性，并且其神经毒性效应可能与较高剂量存在明显差异。例如，1、5和15 μmol/L BPA显著抑制了斑马鱼的运动能力[26]，但极低剂量(0.006 8 μmol/L)BPA和BPS却均能诱导斑马鱼幼鱼多动[34]。尽管目前关于“低剂量”的浓度范围界定尚不明确，但有两个研究团队相继提出低于50 mg·kg-1·d-1且在环境浓度相关剂量(ng-μg级别)范围内的BPA即为“低剂量”[70-71]。已有研究报道，双酚类化合物的内分泌干扰效应往往遵循“U形”剂量-效应关系，即中等浓度会激活动物体内针对该化学物质的生理防御机制，但在低浓度范围内，该化合物能模拟内源激素而发挥作用[72]。鉴于此，低剂量与较高剂量的双酚类化合物可能分别通过不同的作用机制发挥神经毒性效应，并且低剂量双酚类化合物的神经毒性作用机制(尤其是在早期发育阶段的影响)更值得研究者们关注。