揉搓与稀碱联合预处理对水稻秸秆酶解产糖率及结构的影响

马贤武，王 凯，刘 轩，荣昭强，李晓林，刘玉涛

(南京农业大学工学院/江苏省智能化农业装备重点实验室，江苏 南京 210031)

秸秆的资源化利用是解决中国秸秆过剩问题的根本途径[1]。目前中国主要农作物秸秆理论资源量为 1.04×109t，其中水稻秸秆为 2.99×108t；但由于农村能源结构的改变和各类替代燃料的应用，加上秸秆资源分布零散、体积大、收集运输成本高，以及综合利用经济效益差，产业化程度低等原因，导致秸秆出现了地区性、季节性、结构性过剩，对生态环境造成极大的威胁，因而寻求秸秆的合理利用方式已迫在眉睫。

水稻秸秆主要成分为纤维素、半纤维素和木质素，其表面覆盖有蜡质层和硅质层，使得纤维素难以被降解利用。通过预处理打破秸秆的复杂结构是提高其利用有效性的重要手段。预处理方法主要有物理预处理、化学预处理、生物预处理以及联合预处理等。物理预处理能够减少秸秆的尺寸、增大与反应物的接触面积[2]且不会产生后续反应的抑制物[3]，有利于乙醇和甲烷产量的提升，但其能耗较高导致经济上不可行[4]；化学预处理的效率较高，但容易导致半纤维素的损失，抑制物产生和二次污染[3]。因而，能否针对水稻秸秆的特点，部分破坏其表面结构，从而减少预处理的能源消耗和降低后续化学预处理碱的用量，值得研究。

前期研究发现单独揉搓预处理后水稻秸秆的硅质层遭到破坏，为后续厌氧发酵产气提供了良好的条件，但其酶解还原糖产量却没有得到明显提升。因而，本试验将利用揉搓后联合稀Ca(OH)2溶液对水稻秸秆进行预处理，研究其对酶解还原糖产生率及硅质去除率、结晶度和化学成分的影响，旨在为水稻秸秆高效资源化利用提供一种环境友好且可大规模应用的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验选用江苏省南京市六合区收获的水稻秸秆为材料，测得其总固体质量浓度(TS)为90.02%，挥发性固体质量浓度(VS)为76.84%，灰分含量为14.08%。对照秸秆自然风干后剪成 2～3 cm小段备用，揉搓处理秸秆通过机器处理后获得。

化学试剂：试验中的化学试剂均购自上海晶纯生化科技股份有限公司，均为分析纯。

1.2 试验仪器

紫外分光光度计(UV-2008)由尤尼柯上海仪器有限公司生产，X射线衍射仪(X’Pert PRO)由荷兰帕纳科公司生产，傅立叶变换红外光谱仪(Nicolet iS10型)由赛默飞世尔科技(中国)有限公司生产。

1.3 水稻秸秆的预处理方法

1.3.1 揉搓预处理 揉搓预处理机的工作原理如图1所示。水稻秸秆进入喂入口后，受到喂入口处锤片的打击，被打断、打折的秸秆受到锤片的抓取和气流的抽吸双重作用，被带入揉碎室，进入揉碎室内的物料受到锤片和齿条的冲击、揉搓以及揉碎室内的流场作用，被逐渐加工成丝段状，最后推送至抛送口处，被抛出揉搓机。

图1 揉搓预处理机示意图Fig.1 Working principle diagram of the rubbing pretreatment

1.3.2 揉搓与稀碱联合预处理 将揉搓过的水稻秸秆采用稀Ca(OH)2溶液处理，设置Ca(OH)2质量浓度、处理时间和处理温度3个试验因素，分别取2%、4%、6%，6 d、7 d、8 d和20 ℃、40 ℃、60 ℃ 3个水平,进行正交试验。将反应后的样品用盐酸中和至中性，洗净过滤，保留固体残渣，放入105 ℃烘箱中烘干后粉碎，分别用40目、60目、200目标准筛筛选出所需粒度的样品，密封常温备用。

1.3.3 稀碱预处理 根据正交试验得到的最佳质量浓度、时间及温度组合条件处理原始秸秆。反应后的处理步骤与方法1.3.2相同。

经过以上预处理，得到了原始秸秆、揉搓秸秆、稀碱处理原始秸秆、稀碱处理揉搓秸秆4个不同的处理样品，分别记为原始、揉搓、原始+碱、揉搓+碱。

1.4 性能测试表征及检测方法

1.4.1 酶解还原糖的检测 精确称取不同预处理之后过60目筛的水稻秸秆样品0.2 g，放入锥形瓶中，并加入20 mg纤维素酶，以pH=4.8 NaAc-HAc缓冲液定容至50 ml，混匀后置50 ℃恒温水箱中反应48 h。本研究选用3，5-二硝基水杨酸法检测水稻秸秆酶解后还原糖产量[5]。酶解还原糖产生率=还原糖产量/水稻秸秆的质量×100%；酶解还原糖提高率=(处理秸秆酶解还原糖产生率-对照秸秆酶解还原糖产生率)/对照秸秆酶解还原糖产生率。

1.4.2 水稻秸秆硅去除率检测 硅含量检测方法参照文献[6]、[7]。精确称取不同预处理之后过60目筛的水稻秸秆样品0.1 g，放入50 ml离心管中，加入3 ml质量比为50%的NaOH消化液，使用涡旋振荡器混合均匀，保证消化液充分浸润水稻秸秆，放入立式压力蒸汽灭菌器中121 ℃消化20 min后，使用定性滤纸过滤并定容至50.0 ml，在20.0 ml试管中依次加入5.4 ml去离子水、400.0 μl样品溶液、3.0 ml 0.26 mol/L盐酸和400.0 μl 10%钼酸铵，均匀混合后静置5 min，再依次加入还原剂20%酒石酸溶液400.0 μl和400.0 μl 2%抗坏血酸溶液，均匀混合后静置25 min，紫外分光光度计预热20 min后，在600 nm波长处比色皿测定。最后根据不同质量浓度硅标准液吸光度结果所拟合出来的标准曲线求出各吸光度对应的硅含量。硅去除率=(处理秸秆硅含量-对照秸秆硅含量)/对照秸秆硅含量。

1.4.3 X射线衍射光谱分析 取不同预处理之后的过60目筛水稻秸秆样品，均匀放入玻片凹槽中压实，用X射线衍射仪进行扫描。测试条件：铜靶，λ=0.154 mm，管压40 KV，电流40 mA，扫描步长0.02°，扫描范围 10～45°。纤维素的结晶度(CrI)一般参照Segal经验法[8]计算：CrI=[(I002-Iam)/I002]。式中：I002表示2θ在22°和23°之间的最大衍射强度；Iam表示2θ在18°和19°之间的最小衍射强度。

1.4.4 FTIR红外光谱分析 取不同预处理之后的过200目筛水稻秸秆，加入约为样品质量100倍的KBr(溴化钾)于研钵中，混合均匀后研磨20 min，放入YB-2压片机中制备试样，再利用傅立叶红外光谱仪扫描试样。扫描次数：16次，扫描区间：4 000～500 cm-1。根据所得到的红外光谱分析不同预处理后秸秆内部官能团的变化。

1.4.5 不同处理水稻秸秆的成分分析 不同处理水稻秸秆中纤维素、半纤维素和木质素的含量测定参考美国国家可再生能源实验室的方法[9]。

1.5 数据处理

2 结果与分析

2.1 揉搓与稀碱联合预处理对水稻秸秆酶解产糖率的影响

2.1.1 稀碱处理揉搓秸秆的最佳工艺条件 以酶解产糖率为指标，通过正交试验得出稀碱处理揉搓水稻秸秆的最佳工艺条件。正交试验的设计及结果分析如表1所示。

根据表1中的极差值(R)的大小分析，可知影响酶解产糖率的因素强度从大到小依次为：处理时间、稀碱质量浓度、处理温度。且根据表中K值可推导出最佳预处理条件：即Ca(OH)2质量浓度6%、处理温度60 ℃、处理天数8 d。为了验证试验数据的可靠性，在得到的最佳预处理条件下进行3组平行验证试验，测得其酶解产糖率为 33.67%，均高于正交实验表中的9组数据。但发现正交试验表中第4组[处理温度40 ℃、Ca(OH)2质量浓度6%、处理时间6 d]，其酶解产糖率为 33.62%，与最佳预处理条件酶解产糖率无显著性差异。从经济成本和能源消耗角度出发，第4组所消耗的成本要比最佳组合小的多，故选择第 4组为最优预处理条件。

表1揉搓秸秆稀碱预处理酶解产糖率正交试验结果

Table1Theorthogonaltestresultsofenzymatichydrolysissugaryieldbyrubbing-alkalipretreatment

序号处理温度(℃)稀碱质量浓度(%)处理时间(d)酶解产糖率(%)1202630.36 2204730.49 3206831.10 4406633.635402726.91 6404831.68 7604631.07 8606730.57 9602833.07 K191.9590.3495.06 K292.22 93.24 87.97 K394.7195.3095.85 K—130.65 30.11 31.69 K—230.74 31.08 29.32 K—331.57 31.77 31.95 极差(R)0.92 1.66 2.63

2.1.2 不同预处理对水稻秸秆酶解产糖率的影响 为了验证稀碱与揉搓联合预处理的有效性，分别测定了原始秸秆、揉搓秸秆、原始秸秆+碱[处理温度40 ℃、Ca(OH)2质量浓度6%、处理时间6 d]、揉搓秸秆+碱[处理温度40 ℃、Ca(OH)2质量浓度6%、处理时间6 d]4种预处理秸秆酶解还原糖产量，结果如表2所示。

由表2可以看出，经过揉搓预处理后的水稻秸秆酶解产糖率与原始秸秆间没有显著差异(P>0.05)，这与前期的试验结果一致。经过稀碱预处理后的秸秆酶解产糖率为29.86%，较未处理的原始秸秆提升了61.41%，说明稀碱破坏了水稻秸秆的内部结构，提高了纤维素的降解率。揉搓和稀碱联合预处理的水稻秸秆酶解产糖率得到进一步提升，达到了33.63%，与稀碱处理秸秆及揉搓秸秆的酶解产糖率都有显著差异(P<0.05)，较原始秸秆提升了81.76%，说明揉搓预处理能够加强稀碱预处理的作用效果。

2.2 不同预处理对水稻秸秆硅去除率的影响

分别测定了4种预处理情况下水稻秸秆的硅含量，结果如表3所示。水稻秸秆外表面附有一层硅，不仅是疏水性的，而且坚固，能够有效保护内部的木质纤维素结构。因此打破水稻秸秆的硅保护层，使得水稻秸秆木质纤维素结构暴露出来，可以大幅提升水稻秸秆的利用率。通过对硅去除率的分析，可以初步了解揉搓与稀碱联合预处理的作用机理。

表2不同预处理对水稻秸秆酶解产糖率影响

Table2Effectofdifferentpretreatmentsonyieldofenzymatichydrolyzedreducingsugarofricestraw

处理方式 酶解产糖率(%)酶解还原糖提高率(%)原始秸秆18.50±0.15a0揉搓秸秆19.60±0.30a5.95原始秸秆+碱29.86±1.95b61.41揉搓秸秆+碱33.63±0.74c81.76

同一列数据后不同字母表示在0.05水平上差异显著。

由表3可以看出，揉搓预处理可以有效去除水稻秸秆表面的硅质层，其硅去除率可达33.40%，而稀碱对硅去除率影响不明显，该结果可以解释揉搓与稀碱联合预处理的作用机理，即揉搓预处理使水稻秸秆表面的硅质保护层被破坏，从而使稀碱更好地作用于内部的木质纤维素，提升了木质纤维素的利用率。

表3不同预处理对水稻秸秆硅去除率的影响

Table3Effectofdifferentpretreatmentsonremovalratioofsiliconofricestraw

处理方式 水稻秸秆硅含量 (%)硅去除率(%)原始秸秆9.96±0.08b0揉搓秸秆6.63±0.13a33.40原始秸秆+碱9.57±0.13b3.92揉搓秸秆+碱6.17±0a38.05

同一列数据后不同字母表示在0.05水平上差异显著。

2.3 不同预处理对水稻秸秆结晶度的影响

纤维素是构成水稻秸秆木质纤维素的主要成分，其具有结晶区和无定形区两相结构。而纤维素的结晶度是指结晶区占纤维素整体的百分比[10]。因此，常用X射线图谱来分析研究纤维素的结晶程度。

不同预处理后的水稻秸秆XRD图谱和结晶度如图2所示。经过不同预处理之后，XRD图谱中各衍射峰的位置基本没有改变，只是衍射峰的强度有所差异。相比于原始秸秆和揉搓秸秆，经过稀碱处理后的水稻秸秆其衍射峰强度在040和002处都明显升高，说明稀碱预处理可以使水稻秸秆结晶区的有序性得到提升。根据结晶度计算结果可以看出，经过碱处理的原始秸秆和揉搓秸秆，其结晶度都得到了有效提升，且4种预处理方式中，揉搓与碱联合预处理组结晶度最高，相比于原始秸秆结晶度由42.47%提升至54.31%。这是由于经过揉搓和稀碱联合预处理后，水稻秸秆中位于无定形区的木质素和半纤维素部分被溶出降解[11]，使纤维素的相对含量增加，从而提升了水稻秸秆的结晶度。

图2 不同预处理后水稻秸秆的XRD图Fig.2 X-ray diffraction spectra of rice straw by different pretreatments

2.4 不同预处理后的水稻秸秆红外光谱分析及成分分析

秸秆的纤维素和木质素含量能够有效反映预处理的效果和解释酶解产糖率高低的原因，因而对不同预处理水稻秸秆的成分和FTIR红外光谱进行了分析，结果如表4和图3所示。

由表4可知，揉搓预处理使得水稻秸秆纤维素的相对含量由29.35%提升到35.46%，而木质素相对含量由23.82%降低到18.38%；加碱预处理能够大幅提高纤维素的相对含量和降低木质素的相对含量，分别提高或降低到42.58%、11.88%；揉搓预处理能够加强稀碱的作用效果，水稻秸秆揉搓后联合稀碱预处理的纤维素相对含量由未揉搓原始秸秆稀碱处理的42.58%提高到47.51%，木质素含量略有降低。

图3为不同预处理后水稻秸秆的红外光谱图，可以看出，不同预处理的图谱形状大致相似，但部分特征峰的吸收强度发生了变化，这表明，经过不同预处理后，水稻秸秆化学组分相对含量发生了变化。在波数3 420 cm-1处为羟基(-OH)基团伸展振动吸收峰，各处理在此波数下吸收峰强度较原始秸秆明显减弱，其中揉搓和稀碱联合预处理之后吸收峰强度最弱，这说明经过揉搓和稀碱联合预处理后，水稻秸秆中氢键断裂，纤维素、半纤维素和木质素之间的连接被破坏。在1 595 cm-1和1 510 cm-1处为木质素收缩振动吸收峰[12]，可见揉搓和稀碱联合预处理之后该特征峰相对吸收强度与其他3组相比明显减弱，说明木质素得到了有效去除，这与表4所得到的结果相符合。

通过不同预处理水稻秸秆的光谱和成分分析，可知揉搓和稀碱联合预处理有利于木质素相对含量的降低和纤维素相对含量的提升，从而有利于酶解还原糖含量的提高。

表4不同预处理对水稻秸秆成分的影响

Table4Effectofdifferentpretreatmentsoncompositionofricestraw

处理方式 纤维素含量 (%)半纤维素含量 (%)木质素含量 (%)原始秸秆29.3520.7423.82揉搓秸秆35.4623.2018.38原始秸秆+碱42.5822.1111.88揉搓秸秆+碱47.5123.6411.30

图3 不同预处理后水稻秸秆的红外光谱图Fig.3 Flourier transformation infrared spectroscopy spectra of rice straw by different pretreatments

3 讨 论

揉搓和稀碱预处理具有良好的协同作用。揉搓和稀碱联合预处理后秸秆酶解产糖率为33.63%，硅去除率达38.05%，可以明显提高秸秆的结晶度，有效破坏木质素的束缚作用，是一种适于大规模应用的高效的秸秆预处理方式。

结合酶解产糖率和经济成本等因素考虑，获得秸秆揉搓后Ca(OH)2处理的最佳工艺参数为：Ca(OH)2质量浓度6%，处理温度40 ℃，处理天数6 d。

水稻秸秆经过揉搓预处理之后，其表面硅去除率可达到30%以上。而稀碱预处理可以使秸秆中木质素和半纤维素分子间酯键发生皂化反应，使得纤维素、半纤维素和木质素间的交叉连接作用减弱，从而使木质纤维原料的孔隙度增加[13]。结合酶解产糖率结果来看，只经过揉搓预处理对水稻秸秆酶解产糖率作用效果不明显，但可以增强后续稀碱处理的作用效果，在相同的稀碱处理条件下，经过揉搓处理的秸秆相比于原始秸秆，其酶解产糖率得到了有效的提升。从X射线衍射光谱、FTIR光谱和秸秆成分测定结果来看，水稻秸秆经过揉搓和稀碱预处理后木质素得到明显去除，纤维素的相对含量得到了进一步提升，前人研究发现，纤维原料中的木质素对纤维素酶与底物的接触形成立体阻碍，同时还能够非特异性吸附纤维素酶[14-15]，而揉搓与稀碱联合预处理，能有效去除秸秆表面硅质和内部的木质素，使纤维素酶更好地作用于纤维素，从而提高了水稻秸秆木质纤维素的利用率。揉搓与稀碱联合处理的协同作用效果，与唐洪涛等[16]发现的较低剂量γ射线辐照(0～200 kGy) 可以大幅降低后续碱浸泡处理所需的用量和时间有一定的相似性，但相比于γ射线辐照和稀碱结合处理以及张婷[17]所采用的超声波和稀碱联合预处理手段，揉搓与稀碱联合预处理的处理条件比较温和，所需的经济成本也更少，可以作为水稻秸秆大规模高效资源化利用的方式。

本试验采用Ca(OH)2作为代表性碱，缺乏揉搓与其他碱协同作用效果的比较研究，另外如何有效地将试验废液中的Ca2+回收利用，有待于进一步研究。