糖酵解代谢旁路与树突状细胞诱导免疫耐受的相关性

刘会佳，武志坤，崔 萌，邓晓红综述，宋秀娟，侯慧清，郭 力审校

树突状细胞(dendritic cell,DC)是人类目前已知的免疫系统功能最强大的抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)，其功能为高效地识别、捕获、呈递抗原，从而激活抗原特异性T细胞，启动免疫应答，因此在固有免疫应答(innate immune response)及适应性免疫应答(adaptive immune response)中均具有重要作用。

DC自1973年被加拿大科学家Steinman[1]发现以来，一直是自身免疫性疾病研究的重点。近来关于DC代谢的研究越来越多，研究发现不同类型的DC具有不同的代谢旁路，用以满足其生物学代谢功能的需求；同时，不同的代谢旁路也决定了免疫细胞的表型及功能。

DC必须在激活或成熟后才能发挥诱导免疫应答的作用。因此，本文通过对促DC成熟的代谢通路进行综述，以期为研究抑制DC成熟、诱导免疫耐受及自身免疫性疾病的临床治疗提供新的方向。

1 DC分类

DC据来源分为髓样DC(myeloid dendritic cell,mDC)与浆样DC(plasmacytoid dendritic cell,pDC)，在人类即为DC1与DC2。DC1与粒细胞、单核细胞有共同的前体细胞，能分化为巨噬细胞，分泌白细胞介素(interleukin,IL)-2、IL-12、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)；DC2与T细胞、自然杀伤细胞有共同的前体细胞，能够分化发育为淋巴细胞，通过Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)识别病毒和自身核酸结构，分泌干扰素α(interferon-α,IFN-α)[2]。二者均起源于骨髓中CD34+多能造血干细胞(CD34+Hematopoetic progenitor cell,CD34+HPC)，而后由骨髓迁移到外周血中，到达各个淋巴器官。

DC根据成熟程度分为成熟树突状细胞(mature dendritic cell,mDC)及未成熟树突状细胞(immature dendritic cell,imDC)，二者在表型及功能上均有所不同，DC具有根据其自身成熟状态诱导或抑制免疫反应的能力。ImDC表达一系列的模式识别受体，包括TLRs以保证当炎症刺激及微生物侵袭时能够识别并快速应答，功能主要为识别、摄取、呈递抗原。其常规存在于除脑以外身体的其他非淋巴组织，处于免疫耐受状态；当受到炎症信号如脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激时，DC迁移至次级淋巴器官并诱导主要组织相容性复合体I/II(major histocompatibility complex I/II,MHC I/II)，基因编码趋化因子受体、共刺激分子、细胞因子的表达，活化为mDC，摄取抗原能力下降，加工、提呈抗原能力增强，活化初始T细胞，诱导免疫应答[3]。

DC根据其分布部位大致可分为淋巴组织中DC：如滤泡样DC(follicular DC,fDC)、并指状DC(interdigitating cell,iDC)等；非淋巴组织中DC：如间质性DC、朗罕细胞(langerhans cell,LC)等；以及血液中DC。DC根据导致的免疫反应类型分为启动免疫应答DC(immunogenic DC,iDC)和诱导免疫耐受DC(tolerogenic dendritic cell,tol-DC)。

2 DC诱导免疫应答的作用

当机体受到炎性刺激信号如病原体、TNF-α等刺激后，DC主要通过3类信号向初始T细胞传递信息，激活初始T细胞，起到诱导免疫应答的作用。第一信号：DC摄取抗原后，处理成抗原肽- MHC复合物表达于细胞表面，被T细胞表面的T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)识别；第二信号：DC表面表达共刺激分子80(costimulatory molecules 80,CD80)、CD86、CD40等，必须同第一信号共同刺激T细胞才能使其充分活化，诱导免疫应答反应，故又称协同刺激信号；第3信号：DC通过分泌IL-6、IL-12、IL-10、转化生长因子β(Transforming growth factor-β,TGF-β)、TNF-γ等决定初始T细胞分化为效应T细胞还是辅助性T细胞，激活或抑制免疫反应。因此，DC是固有免疫和适应性免疫的桥梁。

3 DC的糖酵解代谢旁路(glycolysis pathway)

代谢在免疫细胞中的作用至关重要，第一，它是提供能量的一种方式，用于满足细胞所需能量，维持其生存、增殖、细胞因子的分泌等功能。在大部分的细胞中，氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)提供了其中大部分的能量[4]。第二，提供原料进行DNA修饰及蛋白质合成。与免疫相关的代谢途径包括以下6种：糖酵解、三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环、磷酸戊糖途径(Pentose Phosphate Pathway,PPP)、脂肪酸氧化、脂肪酸合成、氨基酸代谢，可影响免疫细胞的功能[5]。DC通过发育、静止、激活来发挥其不同阶段的生物学功能。在DC发育成熟的过程中，不同阶段的DC代谢旁路也不同，用以满足其生物学功能的需求,这也使得我们通过调节DC代谢改变DC表型和功能，达到诱导免疫耐受的目的具有可能性。

在生物供能的角度讲，与氧化磷酸化相比，糖酵解产生ATP的能效低，但产生速度却较快。在发生免疫应答时，糖酵解可以维持细胞的能量供给，并保护DC的生存能力。当感染、炎症发生时，氧供给不足，此时糖酵解可以更好的发挥作用，快速提供ATP，进而促进合成、分泌DC成熟所需物质，如：致炎性细胞因子等。

广义的糖酵解途径是指在缺氧或无氧条件下于胞液中将葡萄糖分解代谢为丙酮酸并产生少量三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)的过程。生成中间代谢产物：6磷酸果糖(glucose-6-phosphate,G6P)后的代谢主要有两条分支，其中一条为PPP，可以生成核酸和脂肪酸合成所需的重要辅助因子-NADPH。另一条为丙酮酸途径，生成的丙酮酸一部分进一步代谢转变为乳酸、NAD+和ATP，反馈作用于糖酵解代谢旁路，另一部分进入线粒体内生成乙酰辅酶A(acetyl-CoA)，参与到TCA循环中[6]。丙酮酸的代谢方向由PKM1和PKM2决定。PKM1能促进丙酮酸在线粒体的氧化；决定缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)可以通过上调乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase A,LDHA)的表达促进丙酮酸转化为乳酸，PKM2可以促进HIF1α的表达。目前，对于DC中PKM1和PKM2的功能还有待进一步研究。

3.1 P13K-AKT-mTOR通路 磷脂酰激酶3羟基酶(phosphoinositide 3 kinase,PI3K)-AKT是一类广泛存在于细胞质中的信号转导途径，主要参与细胞分化和抑制凋亡。AKT是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，其活性主要与磷酸化水平相关。AKT作为PI3K下游的主要目标因子，刺激细胞膜表面的葡萄糖转运体1的表达，从而促进细胞质内葡萄糖聚集，促进糖酵解快速发生[7]，增强细胞无氧糖酵解水平。AKT下游激酶雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)也是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，有两种亚型mTOR C1和mTOR C2，在调节细胞代谢中具有重要作用。P13K-AKT信号通路激活后，活化mTOR促使AKT磷酸化，进一步解除增强内转录因子HIF-1α的稳定性，调节线粒体氧化磷酸化转向糖酵解来提供能量[8]。除了通过HIF-1α直接在转录水平调节糖酵解，mTOR可以通过表达依赖一氧化氮合酶iNOS(inducible nitric oxide synthase,iNOS)：抑制OXPHOS，产生NO：下调线粒体的功能[9]，使细胞在缺乏线粒体呼吸作用的情况下转化为糖酵解代谢，间接调节TLR诱导炎性DC的糖酵解作用[10]。正如Everts等人[9]研究发现LPS刺激infDC后24 h内，iNOS表达增加，内源性NO生成增多，NO抑制线粒体内电子传递链，并且5’腺苷一磷酸激活蛋白激酶(5’adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)途径被抑制，从而抑制OXPHOS，糖酵解代谢增强。而为验证该通路，该小组应用己糖激酶抑制剂：2-脱氧葡萄糖(2-deoxyglucose,2-DG)抑制糖酵解后，发现iNOS infDC的数目明显减少，而其他DC亚群无明显变化。Wei等人[11]研究发现应用2-DG抑制DC糖酵解后促使了Th17细胞向调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)方向转化。另有研究应用PI3K抑制剂LY294002后发现LPS诱导的糖酵解显著降低[12]。生长因子受体如GM-CSF可以激活PI3K/Akt。当GM-CSF用于未成熟的静息状态的DC细胞中时，Akt被活化。

3.2 TBK1/IKKε-AKT途径 然而，DC细胞成熟早期所须的糖酵解代谢旁路并非在缺氧或无氧条件下发生的。近期研究表明，早期TLR诱导糖酵解支持DC激活的合成代谢需求并不依赖mTOR 或HIF-1α信号通路，而是取决于AKT。Everts等人[13]采用光谱-色谱分析法追踪1,2-13C葡萄糖，从而证明了与对照组相比，当脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激BMDC 1 h后，葡萄糖更加迅速的将其碳源传递给了丙酮酸盐和乳酸盐，体外培养CD24+DC，以TLR刺激并观察其细胞外酸化率(extracellular acidification rate,ECAR)快速增长，这代表乳酸生成增多，糖分解代谢增加。氧耗率(oxygen consumption rate,OCR)和ECAR能够分别用于评价线粒体呼吸作用和糖酵解[14]。研究揭示了以下代谢途径：以LPS作用于DC后数分钟内，TLR被激活，通过其下游TANK结合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)/核因子-κB激酶ε亚基(nuclear factor-κB kinase subunit-ε,IKKε)，致Akt发生磷酸化，从而促进糖酵解的限速酶之一：己糖激酶(hexokinase,HK)-Ⅱ与电压依赖性阴离子通道结合，HK-Ⅱ易位至线粒体外膜，启动糖酵解，而快速增加的糖酵解最终生成柠檬酸盐，通过slc25a1转运至细胞液内进行脂肪酸合成。易位后，HK-Ⅱ可直接获得高浓度的ATP，从而进一步增强其酶活性。增加的糖酵解通过作为PPP和TCA循环的碳源支持来补充NADPH和柠檬酸，促进利用二者进行脂肪酸的从头合成。脂肪酸合成增加是为了提供内质网和高尔基体扩张所需的膜结构，以满足DC对早期激活标记物的翻译、转运和分泌以及分泌促炎细胞因子的需求。因此，TBK1/IKKε-AKT通路才是快速诱导有氧糖酵解的通路。与此一致的是：在透射电子显微镜下观察发现在被激活的DC中糖酵解迅速增强，内质网和高尔基体以一种依赖脂肪酸从头合成的方式在扩大。被激活后，DC保持糖酵解这个过程对于持续其存活是必不可少的，并且通过mTOR和HIF-1α被控制[6]。而无论在体外还是体内实验中，抑制这一早期的代谢途径改变将会抑制DC的激活、迁移、及T细胞激活[10]。这一过程可以被AMPK抑制，AMPK是脂肪酸β氧化的中枢调节器。

IKKε和TBK1是非经典IKB激酶家族(IKB kinases,IKKs)的成员，二者结构相似，N端为激酶区域，C端为NEMO结合域，此外，还包括羧基端的亮氨酸拉链结构和螺旋-环螺旋结构。在经典的核因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路中，IKKε与TBK1形成异源二聚体，磷酸化并激活NF-κB和IFN调节因子(IRF)，导致促炎性细胞因子、趋化因子和Ⅰ型干扰素(type Ⅰ interferon,IFN Ⅰ)产生增加，促进免疫应答及炎性疾病的发生，因此又称为NF-κB的额外活化激酶[15]。IKKε/TBK1的活化依赖自身磷酸化和经典IKK复合物介导途径两种方式激活，其中作用最强的炎性刺激因子为TLR3、TLR4、RIG-Ⅰ[16]。

4 调节DC代谢与免疫性疾病的治疗

操纵细胞代谢以达到治疗目的已经不是一个新兴的观点了。在肿瘤领域，人们倾向于应用药理学方法抑制合成代谢或糖酵解来抑制肿瘤的生长[17,18]。近年来，对于诱导离体DC产生免疫刺激性自体DC疫苗的研究成为了重点，其中一些疫苗已经应用于肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病、变态反应性疾病等领域的临床研究或疾病治疗中。如：已有一项Ⅰ期临床试验开始应用tol-DC治疗Ⅰ型糖尿病[19]；应用地塞米松、维生素D3加载上滑液及自体DC治疗类风湿性关节炎[20]；联合维生素D3通过增强CD4+CD25+抑制性T细胞治疗牛皮癣[21]等。而其中前列腺癌DC疫苗作为第一个针对癌症的DC疫苗，已经被美国FDA批准上市[22]。多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是T细胞介导的，以白质脱髓鞘、轴索损伤为主要病理特点的中枢神经系统慢性炎性疾病。在MS患者脑脊液循环中可检测到分泌促炎因子的DC，此DC水平已经成为了MS患者的一项临床检测指标。除了通过对Th1/Th2细胞平衡的调节治疗疾病，已有研究应用tol-DC诱导复发缓解型多发性硬化(relapsing-remitting multiple sclerosis，RRMS)患者体内产生抗原特异性低反应性T细胞[23]。目前，已有两项Ⅰ期临床试验在临床试验上登记，评估负载MS患者NCT02618902和NCT02903537髓鞘肽段的tol-DC的可行性与安全性[24]。

此外，地塞米松、维生素D3、雷帕霉素等多种药物可以通过调节代谢途径诱导DC向耐受性DC转变[25]。白藜芦醇通过激活组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase Sirtuin 1)，抑制HIF-1α功能，同时增强过氧化物酶增值活化受体协同刺激分子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α,PGC-1α)的活性而增强分解代谢，促进氧化磷酸化代谢，诱导耐受性DC[26]。罗格列酮可促进线粒体生物合成、上调脂肪酸氧化、干扰TLR介导的DC活化[27]、诱导免疫耐受。实验证明，雷帕霉素作为丝/苏氨酸蛋白酶抑制剂，可抑制mTOR，诱导tol-DC，减轻器官移植术后的排异反应[28]。研究表明在TLR诱导激活的DC中直接抑制糖酵解可以下调Th1细胞表达，上调Foxp3+的辅助T淋巴细胞生成，从而促进免疫耐受[13]。

5 前景展望

研究表明转变代谢途径在诱导DC表型和功能的改变中具有举足轻重的作用，目前已有一些研究应用DC疫苗、tol-DC治疗自身免疫性疾病、改善移植后免疫排斥反应等，但通过调节DC代谢途径诱导免疫耐受还需要进行大量的实验及临床研究，但随着研究不断深入，必将推动自身免疫性疾病的治疗不断发展。