甜菜丛根病研究进展

张辉，白晨，张惠忠，李晓东，付增娟，赵尚敏，鄂圆圆，张自强，王良，张必周

（内蒙古自治区农牧业科学院，呼和浩特 010031）

0 引言

甜菜作为重要的糖料作物，分布在全世界除大洋洲和南极洲外的其他大陆约43个国家和地区。世界上甜菜种植面积大约能占到糖料作物的40%。丛根病是影响甜菜生产的重要病害，能导致甜菜的产量和含糖率严重下降。因此在选育品种过程中，品种的丛根病抗性是很重要的指标。上世纪自发生甜菜丛根病以来，国内科技人员对甜菜丛根病进行了积极的研究，近几年虽引进HYB-74等一些丛根病抗性新品种[1]，选育了农大甜研6号[2]、ZT-6[3]和XJT9907[4]抗耐丛根病甜菜品种，但总体对甜菜丛根病的基础性研究相对不足，远没有国外活跃[5-6]。随着现代分子生物技术的迅速发展，利用分子手段辅助常规育种已经成为育种研究工作的一项新手段。因此本文概述了近年来利用分子方法对丛根病致病机理及相关抗性研究的较新进展，以期为我国甜菜丛根病的深入研究、快速发展提供参考和借鉴。

1 甜菜丛根病类型及发病机理研究

1.1 甜菜丛根病类型研究进展

甜菜丛根病是一种由甜菜坏死黄脉病毒（BNYVV）引起的严重甜菜病害。这种病害是由甜菜多粘菌通过土壤传播的，现在许多甜菜种植的国家都有发现，是甜菜产业在全球范围面临的严重危害。Chiba等在全球范围的BNYVV分离菌株中发现了不同类型的基因序列变异，这些基因变异分别发生在RNA3-p25、RNA4-p31、RNA2-CP和RNA5-p26，其中RNA3-p25基因编码的致病因子是病毒产生致病性的关键因素。在意大利发现的BNYVV分离菌株中p25具有最强的阳性选择，能够不同程度地克服宿主的Rz1抗性基因，而其他地域的分离菌株则不能克服抗性基因的影响，不发病。p25蛋白第67位和第68位的氨基酸的变异会导致致病性发生变化。研究发现，BNYVV病毒最初是在东亚地区发生进化，近年来已成为栽培甜菜品种的病原体，进而形成了新的抗性突变体[7]。多粘菌是许多作物病毒传播的介质。Laufer等研究了BNYVV和甜菜土传花叶病毒（BSBMV）荧光标记技术在烟草共侵染和重叠侵染试验中的应用。共侵染实验表明，在接种后，同一种和不同种Benyvirus的不同标记种群在空间上是分离的。采用差异标记技术对烟草脆裂病毒（TRV）进行联合感染，获得了相同的观察结果。在BNYVV和BSBMV的复合侵染试验中，二者不能在其先前感染BNYVV或BSBMV的植株中建立二次侵染[8]。Galein等采用大量田间取样和室内试验相结合的方法。以不同类型抗性甜菜品种为材料，对BNYVV多样性的进化进行了评价。从1 000多个野生样品中，证实了不同A、B和P型BNYVV的同时存在，在p25四分体的67～70位鉴定了21个变异体。第一种变体AYHR最常见，其次是SYHG。大量混合感染（占样本的9.93%），大多为B型和P型，也已得到证实。与A型或B型相关的四分体也与已知的RNA5基因组相关联，从而使BNYVV对甜菜根具有更强的侵略性。具有Rz1和Rz2抗性基因的品种，即使BNYVV效价较高，也没有表现出明显的根部症状。尽管BNYVV的RNA 3序列具有较广的多样性，但这些品种在生长季末土壤中的病毒侵染潜力也较低。Rz1和Rz2品种的甜菜土传病毒（BSBV）也较低。在田间感染线虫的品种中，Rz1和抗病基因的BNYVV滴度均低于Rz1或同时具有Rz1和Rz2的品种。而且法国甜菜的BNYVV的群体类型往往不同于世界其他地区[9]。关于BNYVV在中国的遗传多样性和种群结构的信息却相对较少。Zhuo等对中国4个基因组区（CP、RNA3、RNA4和RNA5）的BNYVV分离株进行了测序，通过序列比较分析发现不同基因型和p25的四分体结构异变体一起混合组成的这几种病毒分离株。在中国BNYVV病毒群体总共发现了12种不同类型的p25四分体，其中有4种是之前未见报道的。基于4个基因（CP、RNA3-p25、RNA4-p31和RNA5-p26）的系统发育分析揭示中国地区存在2～4个类群。从p25和p26株中国分离株中分别鉴定出两个新亚组和一个新类群。筛选压力分析表明，中国分离株的p25存在正选择压力，而其他3种蛋白则处于负选择压力下。不同省份的BNYVV种群间存在着频繁的基因流动，这意味着不同省份的BNYVV种群没有地理上的差异[10]。

1.2 丛根病检测方法研究进展

目前BNYVV的检测方法有很多，其中比较常用的有表型鉴定法、解剖学鉴定法、酶联免疫吸附法以及RT-PCR法。酶联免疫吸附法和RT-PCR法在实际试验中应用较多，目前以酶联免疫吸附法为基础又衍生出效果更佳的双抗体夹心酶联免疫吸附测定法（DAS-ELISA）。Mehrvar和Decroës等分别利用RT-PCR方法对不同地区和不同类型的丛根病病毒进行检测，对不同类型丛根病病毒进行了分类研究[11-12]。国内刘大丽等利用RT-PCR技术检测BNYVV病毒，在待检测的甜菜块根中检测到了324 bp的丛根病病毒片段[13]。Uhde-Holzem等开发了特异性单克隆抗体方法检测BNYVV病毒，对以病毒样品颗粒（VLPs）作为合成抗原的表达系统进行了相关评价[14]。Yardimci等开发双抗体夹心酶联免疫吸附方法（DAS-ELISA），在土耳其的主要甜菜种植区检测BNYVV病毒，并比较了RT-PCR法和DAS-ELISA法的检测效果，发现RT-PCR法比较适用于BNYVV的检测[15]。Almasi等开发一种新型BNYVV检测方法，通过逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）方法鉴定BNYVV病毒[16]。Nouayti等比较了几种不同甜菜根部BNYVV根病病毒RNA检测方法，发现采用氯化锂技术、工业试剂盒、直接和膜点滴粗提法提取的RNA与其它方法相比，具有较高的纯度和较高的RNA浓度。此6种方法，氯化锂技术和琼脂试剂盒是检测BNYVV前从甜菜样品中提取病毒RNA最合适的方法[17]。目前随着各种新技术的发展，众多新型的方法被用于BNYVV病毒的检测中。

1.3 丛根病的发病机理研究进展

甜菜坏死黄脉病毒基因组由1～5正链RNA组成，病毒RNA1和RNA2编码的基因及复制，与蛋白组装和细胞移动有关。RNAl包含6 746个核苷酸，有1个开放阅读框，编码p237蛋白自身催化切割成两个蛋白（p66和p150），其中p66包括全部的聚合酶，而p150蛋白包含甲基转移酶、解旋酶和类木瓜蛋白酶。RNA2含有 4 612 个核苷酸，它编码 6 个蛋白：运动蛋白（MP）p13、p15 及 p42，外壳蛋白（CP）p21，通读蛋白（RT）p75和1个具有调控功能的蛋白p14[18]。Chiba等对BNYVV和BSBMV中富含半胱氨酸的p14蛋白的RNA沉默抑制特性开展了相关研究工作。发现病毒的p14蛋白与其他病毒致病因子是彼此独立的，一般聚集在核仁和细胞质中。而BNYVV VSR表达则与长距离运动之间存在一定的相关性[19]。p13、p15和p42这3种运动蛋白相互作用促进RNA细胞间运动，其中p42能够和RNA或者DNA捆绑到一起，将病毒包住，而p13和P15可以为p42病毒复合体于胞间连丝处提供一个停泊位点，通过改变胞间连丝的大小，从而使病毒RNA在细胞间进行传递[20-21]。

RNA3包括1 775个核苷酸，从N端起编码3个不同的蛋白：P25蛋白、N蛋白（59个氨基酸）和1个4.6 kDa蛋白，RNA3的存在可以使病毒通过载体传递的效率更高[22]。Flobinus等发现BNYVV在甜菜中的系统运动依赖于病毒RNA3，RNA3含有20个核苷酸组成的核心蛋白基序，这些对于稳定非编码RNA3（ncRNA3）和在物种间的长距离运动起着重要作用[23]。Peltier等研究发现BNYVV RNA3在非寄主转基因拟南芥植株中表达时，并不积累35 S启动子。而在转基因烟草中进行的瞬时表达中发现了一种3′-衍生物。这3′-衍生物的物种类似于以前报道的在病毒感染期间产生的亚基因组RNA3[24]。Wang等研究发现BNYVV RNA3的内源缺失突变体是在系统感染过程中自发产生的，内源缺失并不影响RNA3的有效复制，但可提高RNA3在系统宿主中的稳定性和致病性[25]。Flobinus等发现BNYVV非编码RNA的产生依赖于5′→3′Xrn外显子酶的活性。野生型或突变型RNA3在酿酒酵母中的表达有利于ncRNA3种的积累。对酿酒酵母核糖核酸酶突变体的筛选表明，5′→3′外显子酶Xrn1是RNA3加工过程中的关键酶，在体外和昆虫细胞提取物中都进行了重组。Xrn1以类似黄病毒Xrn1抗性结构（sfRNA）的方式在含有ncRNA3的RNA底物上停滞。用sfRNA序列替代BNYVV RNA3核心序列，可使酵母中ncRNA在体外积累，而不是在植物中积累，且无病毒长距离发生。有趣的是，Xrn4基因的敲除减少了BNYVV RNA的积累，表明核糖核酸酶在病毒循环中具有双重作用[26]。Kozlowska-Makulska等利用转录后基因沉默（PTGS）技术验证RNA3的功能[27]。Bornemann等发现p25蛋白特异性突变的Rb株会影响到抗病性。野生型（WT）和Rb特性的种群通过p25深度测序进行分析，发现分析种群的p25变异水平与Rb性质无关[28]。Thiel H等对BNYVV致病因子p25与含有未知功能F盒家族蛋白（FBK）的甜菜蛋白相互作用展开了研究，证实了甜菜FBK-p25在体内和体外的相互作用，通过酵母双杂交桥联试验，证实了p25对ASK1蛋白SCF复合物的直接作用，研究结果支持了p25参与甜菜病毒致病性的观点[29]。Peltier等将p25蛋白转染到模式生物拟南芥中，通过Southern杂交对转基因植株进行了鉴定，筛选出携带转基因单拷贝和多拷贝的独立株系。发现其对BNYVV感染不敏感，但在表达p25蛋白的植株上出现了不正常的分歧现象[30]。Thiel和Acosta-Leal等也对RNA3的p25蛋白开展了一系列研究，发现p25可以进入到宿主细胞的细胞核和细胞质，进而可以引起宿主叶片发生严重的坏死反应[31-32]。

RNA4含有两个开放阅读框，其中一个开放阅读框编码多粘菌传递病毒不可缺少的p31蛋白[33]。Fan等利用聚焦激光扫描显微镜（CLSM）分析，将RNA4编码p31蛋白融合到红色荧光蛋白（RFP），发现RNA4引起的重度症状可能与p31转录修饰有关。BNYVV的RNA4表达过程中的RNA沉默基因表达的修饰，泛素-蛋白酶体途径、纤维素的合成，以及内源赤霉素代谢可能有助于引发严重症状表现[34]。Wu等发现在BNYVV感染过程中，只有整个p31才能诱导PR-10上调，富含半胱氨酸的p31中的所有色氨酸和6个半胱氨酸（C174、C183、C186、C190、C197和C199）对PR-10的表达有显著影响，这与BNYVV感染的巴氏杆菌严重症状的出现密切相关[35]。RNA5有一个开放阅读框，编码p26蛋白，不是所有RNA病毒都有的[18]。McGrann等研究了BNYVV的组成，RNA5仅限于亚洲和欧洲的某些地区，而且这些分离物往往更具有侵略性[36]。还有相关报道在日本、中国和法国的分离物中发现该类型。一般含有RNA5的病毒较仅含有RNA1～4的病毒，被认为能引起更严重的病害[18，37]。

2 甜菜丛根病分子辅助育种研究

2.1 甜菜基因工程研究进展

近年来基因工程在各种作物上都有大量应用，在甜菜上也有迅速的发展。Jahromi等克隆了BNYVV的主要外壳蛋白 （CP21），并在大肠杆菌中表达，从PCR扩增的免疫球蛋白库中构建噬菌体抗体库，对重组CP21抗原进行了4轮筛选，获得了几条特异性单链FV片段，并对其进行了鉴定[38]。Acosta-Leal等探讨BNYVV群体的遗传寄主效应，将野生型病毒的分离物接种到具有部分抗性的基因Rz1、Rz2以及感病的甜菜品种中，并且克隆了病毒RNA3部分序列，发现病毒的多样性与宿主的抗性强度成正比[39]。PavliO I分别于2011和2012年利用转基因的方法对甜菜进行了转化，发现获得的转化植株对甜菜丛根病具有一定的抗性[40-41]。Delbianco等利用农杆菌接种的方法将含有全长cDNA病毒基因组拷贝质粒的悬浮农杆菌转入到宿主细胞，通过cDNA的转录产生病毒基因组的拷贝RNA，从而引发感染[42]。Jiang等建立了花椰菜花叶病毒35 S启动子控制下的BNYVV全长感染性cDNA克隆。进一步开发了一套基于BNYVV的载体，可在模式植物和甜菜植株中高效表达4种重组蛋白，其中包括一些长度可达880个氨基酸的大蛋白。这些载体可用于研究系统侵染植物叶片、根和茎组织中多种蛋白的亚细胞共定位。此外，以BNYVV为载体的NBPDS引导RNA在表达CaS 9的转基因植株上进行基因组编辑，基于BNYVV的载体将促进甜菜和相关植物中多种蛋白质的基因组研究和表达[43]。Laufer等开展了BSBMV和BNYVV cDNA克隆的生物学特性研究，通过等温体外重组，构建了适合两种病毒基因组接种的载体。发现BNYVV和BSBMV的RNA1、RNA2重组子能进行长距离传播[44]。

国内将分子方法应用于甜菜育种中也较为普遍。刘大丽等利用基因克隆的方法对两类真菌抗性基因At Chitinase1和At Glucanase2的功能域进行了克隆，获得两个抗病基因功能片段[45]；2018年将编码谷胱甘肽合成酶的StGCS-GS基因转化到甜菜体内，共获得7个转基因甜菜株系[46]。鲁振强等将草甘膦靶基因At EPSPs的功能域进行克隆获得了抗草甘膦除草剂基因功能片段[47]；2018年采用同源克隆及cDNA末端快速扩增（RACE）的方法，首次从甜菜M14品系中克隆了与生殖相关的基因BvMARB的全长cDNA序列[48]。国内关于甜菜丛根病的相关研究仍很有限。而国外Strausbaugh等研究了甜菜坏死黄脉病毒和冷冻温度对甜菜根贮藏的影响。发现BNYVV不仅会导致感病甜菜品种的产量和蔗糖损失，而且当温度降至-2.2℃以下时，还会产生更多的冻根组织。根据这些观察，整个冬季用于非冻糖甜菜堆根冷却的气温不应低至-2.2°C以下，以最大限度地保持蔗糖[49]。

2.2 组学研究和m iRNA在甜菜丛根病上的研究进展

转录组学和蛋白组的方法也大量应用于甜菜研究中。Webb等研究了感病材料在病毒侵染后蛋白质水平出现哪些变化，通过胁迫处理后取叶片提取总蛋白，用质谱技术进行定量分析。以阐明病毒与宿主植物互作过程中表达的蛋白类型。通过蛋白组学方法鉴定出203种蛋白质，发现功能蛋白主要是光合作用、能量代谢、新陈代谢以及与刺激反应相关的蛋白。这些蛋白与一般植物防御反应的系统获得性抗性有关[50]。张辉等利用蛋白组学的方法研究了BNYVV侵染后不同材料的蛋白质差异蛋白反应，发现不同材料对病毒胁迫处理产生的反应有所不同，抗性材料表达的差异蛋白主要是光合作用蛋白、糖代谢蛋白、呼吸抗氧化作用蛋白、信号转导蛋白以及脂代谢等蛋白；感病材料表达的蛋白主要是光合作用蛋白和呼吸抗氧化蛋白，即自身反应表达的蛋白[51]。Fan等对BNYVV接种后的甜菜提取了总RNA，通过转录组测序获得重新组装的基因序列数据75 917个SNP，平均长度为1 054 bp，通过BLAST比对，获得39 372个SNP注释。预测了4 834个简单序列重复序列（SSRs），通过转录序列的比较分析，发现261个基因在感染的植物中差异表达，128个基因上调，133个基因下调[52]。

植物微RNA（miRNAs）是一类在植物发育、防御和症状发展中起重要作用的非编码RNA。近年来在不同作物上开展了大量的研究。Liu等利用测序的方法鉴定了547个miRNAs，其中包括129个miRNA家族，发现282个新miRNAs。差异表达分析后，对BNYVV感染相关的miRNAs进行微阵列分析和RT-qPCR确证。发现38个miRNA家族包括103个已知miRNAs和45个新miRNAs。而这些具有表达差异的miRNAs参与激素的生物合成和信号转导，进而可以促进腋芽的发育和植物的防御[53]。

3 展望

甜菜丛根病能对甜菜生产造成严重的危害，导致甜菜根产量和含糖率的严重下降。目前，国外科研人员通过长时间的努力培育出了一些具有丛根病抗性资源的品种。国内科研人员在丛根病抗性选择上也付出了很大努力，通过长年的选育工作也取得了一定的成绩，培育出了丛根病抗性品种。但对其育种材料的抗病机理并未研究清楚。因此着眼于国内自育的抗性材料，期望从分子水平对其抗病机理展开一系列研究是我们未来的研究方向。利用现代分子技术方法实现甜菜丛根病抗性品种的快速选育，以建立我国甜菜分子育种创新研究体系，对加快甜菜抗丛根病品种的培育工作有着重要的理论和实践意义。