间充质干细胞治疗心肌梗死的研究进展*

宋晓玥，程灏，陈璐 综述；马剑英 审校

（复旦大学附属中山医院 心内科,上海 200032）

随着社会经济的高速发展，高度城市化和社会老龄化带来的问题日渐突出，居民不健康的生活习惯普遍流行，心血管危险因素普遍暴露。根据《中国心血管病报告2017》概要推算我国心血管病现患人数2.9亿，其中脑卒中1 300万，冠心病1 100万，肺源性心脏病500万，心力衰竭450 万，风湿性心脏病250万，先天性心脏病200 万，高血压2.7亿[1]。我们必须认识到我国乃至全球心血管病发病人数将长期保持高速增长的态势，心血管疾病已成为世界范围内成人死亡和致残的主要原因之一，防治心血管疾病刻不容缓。

心肌梗死是心血管疾病的一种严重表现，是临床上一种严重的缺血性心肌病。梗死的心肌组织逐渐被缺乏弹性的瘢痕组织所替代，为了满足心脏收缩舒张的功能，发生代偿性心腔增大、心肌肥厚，心室发生适应不良性改变导致心室重塑，引起心室泵血功能低下，最终发展成为心力衰竭。梗死后心衰将导致心肌细胞不可逆的丢失，虽然目前的药物治疗、冠脉介入手段、冠脉搭桥手术等临床治疗手段在一定程度上延缓了病情，但并不能逆转疾病的发展。干细胞移植疗法为心肌损伤修复提供了有治疗前景的选择方向，尤其是属于成体干细胞的间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs），具有强大的多向分化潜能和增殖能力，被视为理想的组织修复种子细胞。MAKINO等[2]研究从大鼠间充质干细胞中分离出心肌原性细胞系，在体外用5-氮胞苷诱导处理后30%细胞发生形态改变，表现出成纤维细胞样形态，具有心肌样细胞特点，由此打开了间充质干细胞的心血管研究领域的大门。

1 间充质干细胞定义

干细胞包括胚胎干细胞与成体干细胞，具有自我更新能力和多向分化潜能。间充质干细胞是一类起源于发育早期的中胚层[3]和小部分外胚层的成体干细胞，广泛来源于骨髓、外周血、脐带、胎盘、脂肪及牙髓[4]等组织。早在1976年，FRIEDENSTEIN等[5]首先报道骨髓中一种贴壁、长梭形成纤维样细胞，呈克隆性生长，定义为“成纤维细胞样集落形成单位”。1991年，CAPLAN[6]发现此种细胞有自我更新和分化能力，正式定义为骨髓间充质干细胞（bone marrowderived mesenchymal stem cells, BM-MSCs）。因为缺乏表面特异标志物，间充质干细胞目前尚无统一的定义标准。对人类间充质干细胞，国际细胞治疗协会提出了以下几点定义标准[7]：①标准培养条件下贴壁；②白细胞分化抗原105（cluster of differentiation 105, CD105），CD73和CD90，不表达CD45，CD34，CD19或CD11a和人类白细胞抗原-DR等造血细胞标记物；③体外可分化为成骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞。

2 间充质干细胞特性

2.1 高度自我增殖能力与多向分化潜能

间充质干细胞具有强大的自我更新能力，贴壁后快速生长，经多次传代扩增后仍具有干细胞特性。在体外或体内适当诱导条件下，可分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、韧带、内皮、神经、肝和心肌等多种组织细胞，被视为理想的组织修复种子细胞。

2.2 低免疫原性与免疫抑制反应

间充质干细胞低表达包括CD80、CD86、人类白细胞抗原II（human leukocyte antigen-II,HLA- II）和CD34等在内的共刺激因子，这使得间充质干细胞不但不能诱导免疫应答，而且还有抑制免疫反应的作用[7]，通过与细胞直接接触或者分泌细胞因子抑制T细胞与B细胞的免疫活动[8]。在自然杀伤（natural killer, NK）细胞活化前接触间充质干细胞，NK细胞介导的细胞毒性、细胞因子生成、细胞膜上活化受体的表达和颗粒酶B的释放会被干扰。在间充质干细胞的暴露下，未成熟树突状细胞无法正常分化为成熟的树突状细胞，从而不能有效地活化初始T细胞和刺激T细胞增殖。此外，ABUMAREE等[9]认为间充质干细胞与炎性细胞接触后可分泌白细胞介素-10（interleukin 10, IL- 10）、巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor, M-CSF）、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）、 血 管 内 皮 生 长 因 子（vascular endothelial growth factor, VEGF）等细胞活性分子，从而促进单核细胞向抗炎性巨噬细胞（M2）的分化，同时抑制其分化为促炎性巨噬细胞（M1），以进一步发挥间充质干细胞的免疫抑制作用。

2.3 损伤趋化归巢作用

干细胞归巢是指干细胞移植后在特定条件下定向性移动至靶组织、靶器官的表现。SAITO等[10]首次提出间充质干细胞具有归巢能力。当机体遭遇损伤时，损伤部位会释放特殊的内分泌信号，分泌多种细胞因子、趋化因子、黏附因子，引导干细胞的靶向归巢，发挥组织修复功效。BARBASH等[11]研究发现心肌梗死大鼠静脉输注带有标记的间充质干细胞后，1周内可在梗死区域发现标记细胞，而对照组仅可在骨髓中发现标记细胞。研究[12]发现基质细胞衍生因子-1/CXC趋化因子受体-4（stromal cell-derived factor-1/CXC chemokine receptor type 4, SDF-1/CXCR4）信号通路通过激活Src家族，介导间充质干细胞的趋化作用，招募更多祖细胞到梗死区域修复心脏。

3 间充质干细胞移植的作用机制

3.1 电-机械偶联

由间充质干细胞分化而来的心肌细胞与宿主心肌细胞间以闰盘结构相连，组成功能统一体，形成协调一致的电-机械偶联，改善心功能。KHAN等[13]研究发现camp-Epac-Rap1信号通路的激活可以使间充质干细胞高效地结合在梗死心肌上并且分化成心肌样细胞，从而增强心肌功能。

3.2 分化为心肌细胞

一系列研究证实间充质干细胞可在一定条件诱导下分化成心肌细胞，增加梗死区心肌数量，促进心脏功能的恢复。早在1999年，TOMITA等[14]发现经5-氮胞苷处理的间充质干细胞在体外培养，第10天相互连接肌管形成，第21天心肌特异性肌钙蛋白I和肌凝蛋白重链染色阳性，将诱导后的间充质干细胞移植到大鼠心肌冻伤形成的瘢痕组织,结果瘢痕面积缩小,心功能有所改善。KANG等[15]研究结果表明5-氮胞苷和I型胶原的纳米分子在间充质干细胞移植到梗死区域后，通过形成肌管样结构与相邻细胞连接，增强转录因子GATA-4和Nkx2.5、肌钙蛋白I，β-肌球蛋白重链和心脏的α-肌动蛋白基因的表达。

3.3 旁分泌效应

虽然在体内间充质干细胞可以分化为心肌细胞，但是由于梗死区域复杂的微环境，移植细胞存活难度大，与明显改善的心功能不相匹配，推测间充质干细胞移植到心肌组织后发挥的旁分泌作用是改善心功能的主要机制。BOBI等[16]研究发现心梗动物模型建立成功后，经冠脉注入同种异体脂肪来源间充质干细胞，短期可见凋亡水平降低，VEGF、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）和SDF-1等表达上调，M2巨噬细胞增加；长期来看心肌血流灌注增加，血管密度增加。目前越来越多的研究发现间充质干细胞通过外泌体途径发挥旁分泌作用，进行细胞间交流。ZHANG等[17]发现将间充质干细胞来源外泌体与心脏干细胞共培养，可以增加内皮细胞分化，加强血管新生，减少纤维化，起到修复心肌的功效，提示外泌体是间充质干细胞的关键活性成分。MAO等[18]通过转染的方式使MSCs高表达整合素连接激酶,并将其注射到大鼠梗死心肌上，结果发现其可抑制心肌细胞增殖,降低I型和III型胶原的基因表达，有助于减少纤维化,缩小心梗瘢痕。

3.4 促进血管新生

间充质干细胞不仅可以分化为血管内皮细胞参与血管形成，还可以直接整合到血管上。整合的细胞大部分可以分泌生长因子，促进内皮细胞的成熟进而促进新生血管。JIANG等[19]移植间充质干细胞到大鼠冠脉结扎模型中，4周后通过免疫荧光分析发现，植入细胞部分表达平滑肌表型［α-平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin,α-SMA）］，其他的则表现了内皮表型（CD31）。CHEN等[20]发现将具有分泌肽成纤维细胞生长因子4-碱性成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor 4-basic fibroblast growth factor, FGF4-bFGF）基因转染骨髓间充质干细胞联合治疗，通过促进新生血管生成、抗心肌细胞凋亡、抑制左室重塑多条途径发挥作用而改善大鼠心肌梗死后心功能。

3.5 免疫调节

间充质干细胞有着独一无二的低免疫原性与无主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）限制性，它只表达主要组织相容性复合体MHC-I类分子，而不表达MHC-II类分子和CD80、CD86及CD40等共刺激分子。KRAMPERA等[21]研究发现，间充质的细胞免疫抑制作用，能够抑制梗死的细胞发生炎症反应，从而减少炎症细胞和炎症因子对心肌造成的急性损伤。LUGER等[22]发现在急性心梗或者缺血性心肌病中缺血再灌注过程中，静脉输注间充质干细胞可以缓解左室功能的进行性减弱和逆转心室重塑。这一作用与间充质干细胞介导的抗炎免疫反应有关，抑制NK细胞和中性粒细胞活动。

4 间充质干细胞移植途径

移植途径主要有冠状动脉、静脉、心外膜、心内膜，各种途径都存在优点与缺点，需结合实际情况进行个体化选择。心外膜注射定位准确，但由于创伤较大，主要适用于同时进行冠状动脉旁路移植术的患者。心内膜注射对技术水平和设备要求高，临床上广泛开展具有一定困难。经静脉途径最为简单易行，但ASSIS等[23]观察发现以99Tcm六甲基丙二胺肟（99Tcm-hexamethyl propylene amine oxime, 99Tcm-HMPAO）和4, 6-二氨基-2-苯基吲哚（4, 6-diamino-2-phenyl indole,DAPI）标记的间充质干细胞在经静脉途径移植后，注射后的干细胞约70%分布在肺部,其余分布在心脏、肾脏、脾脏和膀胱，60 min后逐渐减少。由于存在其他脏器的首过效应，只有一小部分间充质干细胞可以成功到达心肌梗死区域，而且过量注射间充质干细胞可以导致静脉栓塞的发生。经导管可以直接注射更多的间充质干细胞到冠脉区域，定位准确，避免心肌注射损伤。但经冠脉注射途径也会遇到问题，比如间充质干细胞体积较大，因操作不当会引起微循环堵塞而加重心肌梗死的症状。基于上述问题，移植途径迎来了革新。LI等[24]发现将超声与微泡技术结合通过上调SDF-1/CXCR4而起到促进间充质干细胞归巢的作用。LUO等[25]将间充质干细胞的分泌因子置于聚乳酸-羟基乙酸共聚物［poly（lactic-co-glycolic acid）, PLGA］微球内，外覆间充质干细胞细胞膜，合成在冷冻或冻干状态下仍然保持稳定的合成间充质干细胞。移植入急性心肌梗死小鼠模型，观察到有明显的促进血管生成和减轻左心室重塑功效。

5 实验研究

缺氧、缺血、缺血再灌注损伤、炎症反应、局部结构改变等微环境不利于移植干细胞生存，为提高间充质干细胞移植效率，增强对缺血缺氧环境的耐受，减少细胞凋亡，助力干细胞治疗发展，进行了一系列对间充质干细胞预处理调节基因表达，通过转染实现基因修饰或者联合药物治疗等的研究，为间充质干细胞治疗提供了新思路。KHAN等[26]发现2, 4-二硝基苯酚（2, 4-dinitrophenol,DNP）对间充质干细胞预处理，可以抑制电子传递链活动，创造缺氧环境，上调与细胞粘附相关的kindlin-3、CD29、CD44和CD90水平，增加间充质细胞存活，粘附和归巢MSCs，改善心脏功能和血运重建。HE等[27]研究发现过表达蛋白激酶Cε（protein kinase Cε, PKCε）的间充质干细胞通过SDF-1/CXCR4轴和PI3K/AKT通路，上调VEGF、bFGF、TGF-β、心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I,cTnI）、血管性血友病因子（von Willebrand factor,vWF）、SMA等水平，提高间充质干细胞的存活和分化增殖能力，改善心功能。SONG等[28]证实阿伐他汀联合间充质干细胞治疗，通过激活腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK）通路促进一氧化氮合酶（nitric oxide synthase, NOS）尤其是内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）的表达及活化，提升新生心肌细胞增殖、抗炎、抗凋亡及抗纤维化的能力。YAN等[29]发现C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白-9（C1q/tumor necrosis factor-related protein-9, CTRP9）水平低下是导致移植的脂肪来源间充质干细胞存活不足和心肌修复作用不足的重要原因，体外实验发现通过细胞外调节蛋白激酶1/2-金属基质蛋白酶-9（extracellular regulated protein kinase 1/2-matrix metalloprotein, ERK1/2-MMP-9）和细胞外调节蛋白激酶1/2-红细胞衍生核因子2样蛋白2（extracellular regulated protein kinase 1/2-nuclear factor erythroid-derived 2-like 2,ERK1/2-NFE2L2）信号通路增强间充质干细胞增殖分化和抗凋亡的能力。

6 临床观察

CHEN等[30]于2004年报道了首个将间充质干细胞应用于临床的随机对照研究，将69名在12 h内发病的急性ST段抬高型心肌梗死患者随机分成两组，分别予以冠脉注射自体骨髓间充质干细胞和生理盐水，随访6个月显示干细胞治疗后室壁运动及左室射血分数有所提高。目前已有众多临床试验和随访结果支持间充质干细胞移植治疗可以使心肌梗死患者获益。2011年LEISTNER[31]报告了迄今最大规模的急性心肌梗死后干细胞治疗随机试验结果，入选的204例急性心肌梗死患者中101例患者初始随机接受间充质干细胞治疗，剩下的103例患者注入安慰剂。随访5年结果显示接受干细胞治疗后射血分数有轻微但稳定的改善，联合临床终点显著改善。CHULLIKANA等[32]在招募的ST段抬高的急性心梗患者中，针对间充质干细胞的安全性和有效性进行了一项随机、双盲、I/II期研究 。结果显示急性心梗患者在血管重建术后2 d经静脉内输注同种异体间充质干细胞耐受性良好，2年长期随访显示不良事件发生率低于对照组。2018年LALU等[33]对间充质干细胞治疗缺血性心脏病的安全性和有效性进行了荟萃分析，尤其是针对急性心肌梗死和缺血性心力衰竭。通过23项临床研究的1 148例患者的数据分析显示，间充质干细胞治疗急性心梗和缺血性心力衰竭的整体结果是安全积极而有效的。

7 总结与展望

间充质干细胞具有来源广泛、高度自我增殖能力与多向分化潜能、低免疫原性等优点，在心肌梗死治疗中取得了一定进展，但在基础研究向临床应用推广的转化医学过程中，还需面对移植存活率低等技术障碍。随着实验技术、研究发现与相关伦理知识的不断完善，相信间充质干细胞作为组织修复的理想种子，可以为挽救心肌梗死患者不可逆细胞损伤带来希望。