时钟基因与肿瘤转移的研究进展

孟熙 金风

作者单位：550004 贵阳 1贵州医科大学临床医学院；550000 贵阳 2贵州医科大学附属医院肿瘤科；3贵州省肿瘤医院头颈肿瘤科

肿瘤转移涉及早期原发癌生长、肿瘤血管生成、肿瘤细胞脱落并侵入基质、癌栓形成、继发组织器官定位生长、转移癌扩散等多个步骤，且与黏附因子、纤维蛋白溶酶、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）、上皮细胞间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［1］、干细胞［2］、机体免疫状态、肿瘤微环境等因素有关。生物钟是生物体内源自主产生的调控系统［3］，由转录翻译水平的多个反馈环组成。时钟基因是构成这些反馈环的基本元件，对多个反馈环具有调节作用［4］。研究发现，时钟基因广泛存在于有机体细胞，调节细胞代谢等生理功能，在肿瘤侵袭与转移过程中发挥促癌和抑癌双重作用［5］。本文将对时钟基因与肿瘤转移的研究进展进行综述。

1 时钟基因概述

哺乳动物的生物钟调节系统可分为3个部分，包括输入通路、中枢“起搏器”和输出通路，其中中枢“起搏器”位于大脑下丘脑的视交叉上核，可产生节律性的输出信号从而调节不同细胞的生物节律。生物体内的多种重要生命活动，如细胞代谢和激素分泌，均受体内生物钟调控［5-8］。生物节律是大多数有机体重要的生物系统［9］。5%～15%的全基因组mRAN表达由时钟基因驱动，生物钟破坏会导致细胞正常生理功能丧失［10］，导致肿瘤发生发展［11］。生物钟基因几乎存在于生物体内的所有细胞［12-13］。20世纪80年代克隆得到果蝇的“周期基因”——Period，从此拉开了时钟基因研究的帷幕［14］。20世纪90年代，有学者发现第一个哺乳动物时钟基因Clock［15］。至今已发现的时钟基因有Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Clock、Bmal1、TIM、CKIε、NPAS2、REV-ERBs、Dec1、Dec2和RORs［16-18］。研究发现，时钟基因Bmal1、Clock、Per1、Per2、Per3和Cry1等与其蛋白产物相互作用，形成由正调控元件Bmal1和Clock以及负调控元件Per12和Cry12组成的转录翻译负反馈环，传导信号至基因组进行转录和翻译后调控［4］。在时钟基因家族中，Per1、Per2、Per3、NPAS2等基因具有抑制肿瘤转移功能［18-22］，Clock、Cry1、Tim等基因具有促进肿瘤转移功能［10，23-24］，而Bmal1基因则具有抑制和促进肿瘤转移的双重作用［25-27］。可见，时钟基因与肿瘤进展密切相关。

2 时钟基因与肿瘤转移

2.1 Per基因家族

Per基因是最早被复制和鉴定的时钟基因［14］，其家族成员包括Per1、Per2和Per3。降解细胞外基质和破坏基底膜是肿瘤细胞侵袭转移过程中的重要步骤，而MMP是降解细胞外基因最重要的蛋白酶类。研究表明，Per1、Per2、Per3基因可通过抑制 MMP表达而抑制肿瘤转移。ZHAO等［18］研究发现，口腔鳞状细胞癌组织中Per1的表达明显下调；进一步建立移植瘤模型，发现移植瘤增殖指数、分裂指数以及肿瘤重量均与Per1 mRNA表达呈负相关，而Per1 mRNA表达与MMP-2 mRNA表达呈正相关。此外，该研究还发现Per1异常表达与口腔鳞状细胞癌生长、增殖与转移有关，认为Per1可能是一个抑癌基因，可能通过调控MMP-2表达而抑制口腔鳞状细胞癌的淋巴结转移。HAN等［19］在胆管癌研究中发现，胆管癌细胞过表达Per1可抑制肿瘤生长、增殖、血管生成及肿瘤转移。而ZHAO等［20］报道与癌旁正常组织相比，胃癌组织中Per1和Per2的表达水平明显下调，两者表达呈正相关，其中Per1表达与患者肿瘤临床分期、浸润深度、淋巴结转移有关，Per2表达与患者肿瘤临床分期、浸润深度有关；Per1和Per2均低表达的患者较均高表达患者生存期更短，Per2是独立的预后影响因素。提示Per1和Per2在胃癌的发生发展、浸润以及预后中起重要作用，Per2有望成为新的预后预测标志物。此外，HUISMAN等［11］研究显示，在人结直肠癌肝转 移 病 灶 中Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3、Cry1和Cry2等7个核心时钟基因表达下调，其中Per3低表达与结直肠癌肝转移的数量显著相关；在人原发结直肠癌组织中亦发现Bmal1、Per1、Per2、Per3和Cry2等5个时钟基因表达下调，说明在结直肠癌的发生发展中，Per3可能发挥抑癌基因作用而抑制肿瘤转移。WANG 等［28］报道 Per1、Per2、Per3基因在头颈部鳞癌组织及头颈部正常组织中均表达，但这3个基因在癌组织中的表达水平较正常组织明显下降，且晚期患者较早期患者下调更明显，认为Per家族基因表达降低可能与头颈部鳞癌发生有关。综上认为，Per1、Per2、Per3可能是抑癌基因，参与肿瘤的发生发展及转移等多个过程。

2.2 Clock基因

Clock基因是时钟基因多反馈环中的正向调控因子［4］。MOMMA 等［9］研究报道，Clock 染色阳性的结直肠癌患者的肿瘤体积明显大于染色阴性者，且Clock染色阳性的患者肿瘤浸润程度更严重，分期更晚。WANG等［23］在结直肠癌研究中发现，癌组织中hClock基因的表达水平较正常组织高，且分化差、Dukes肿瘤分期晚，64.3%伴随淋巴结转移的患者hClock基因的表达水平明显升高。进一步研究［24］发现，敲低hClock基因可抑制结直肠癌细胞转移，且shRNA靶向hClock基因可有效降低结直肠癌细胞在裸鼠中的转移能力。EMT已被证明是一种重要的侵袭转移方式［1］。WANG等［24］研究还发现，hClock过表达可增强血管生成相关基因如缺氧诱导因子1α、芳香烃受体核转位蛋白和血管内皮生长因子（VEGF）的表达，并促进了结直肠癌细胞发生EMT。说明上调时钟基因hClock表达可能促进结直肠癌转移。BOSE等［29］研究发现时钟基因Clock可能促进催乳素的分泌，进而加速乳腺癌组织碳水化合物的代谢，促进乳腺癌的发生发展。此外，血液循环中的肿瘤细胞可能黏附于血管内皮表面，而TANG等［30］研究发现乏氧可导致hClock表达增加，从而诱导 ROS（reactive oxygen species）的产生，激活RhoA激酶信号通路和NF-κB信号通路，引起血管内皮氧化应激损伤及炎症反应的发生，进而可能导致血管内皮表面的黏附位点暴露，为肿瘤细胞穿过内皮细胞之间的连接、穿出血管壁形成转移灶奠定了基础；而抑制hClock则上述信号通路失活。

2.3 Cry基因

Cry基因是时钟基因反馈环中的负调控元件之一，主要包括基因Cry1基因和Cry2基因［4］。HASAKOVA等［31］研究发现，当小鼠的Cry1基因发生突变时，小鼠丧失生理节律，并且移植瘤生长速度加快。目前Cry基因与肿瘤转移的相关研究主要集中在结直肠癌。YU等［10］在结直肠癌研究中发现，Cry1在大多数结直肠癌细胞株中表达上调，可促进结直肠癌细胞增殖及迁移；Cry1在结直肠癌组织中表达亦上调，且与淋巴结转移、TNM分期有关，Cry1高表达还与结直肠癌患者不良预后有关。然而，HUISMAN等［11］在人结直肠癌肝转移病灶中发现，Cry1等核心时钟基因表达下调。表明Cry1基因在结直肠癌不同的转移病灶中表达水平可能不一致。MAZZOCCOLI等［32］研究亦发现与正常黏膜组织相比，结直肠癌患者肿瘤组织中Cry2等时钟基因表达明显下调；邻近淋巴结肿瘤组织中Cry2的表达亦下调。WANG等［33］研究结直肠癌患者Per、Cry和Tim基因的表达情况，发现与结直肠癌患者正常黏膜组织相比，肿瘤组织中Cry2的表达明显降低；与正常淋巴结组织相比，邻近淋巴结肿瘤组织中Cry2表达亦降低，推测Cry2低表达可能促进结直肠癌淋巴结转移。综上认为，Cry1和Cry2在结直肠癌转移中发挥重要作用，有望成为结直肠癌的治疗靶点和预后判断标志物。此外，HABASHY等［34］研究发现慢性淋巴细胞白血病患者表达Cry1，且可能通过上调CD38表达参与慢性淋巴细胞白血病的侵袭过程。CHUN等［35］在乳腺癌研究中发现Cry基因可能通过调控乳腺癌细胞DNA损伤修复而促进乳腺癌发生发展。MTEYREK等［36］研究报道Cry1、Cry2基因缺陷的小鼠罹患胆管癌的风险是野生型小鼠的8倍，推测Cry基因缺陷可能与胆管癌的发生发展有关。

2.4 Bmal1基因

Bmal1基因又称为ARNTL基因，是哺乳动物生命活动中重要的中央时钟元件，位于11号染色体短臂，编码蛋白质Bmal1，属于bHLH-PAS结构域转录因子家族［37］。研究发现，Bmal1基因在肿瘤中既可起促癌作用［25］，也可发挥抑癌作用［26-27］。ELSHAZLEY等［25］研究发现，与非致瘤性间皮细胞系和正常胸膜壁层细胞相比，大多数恶性胸膜间皮瘤细胞系Bmal1的表达水平更高，Bmal1基因敲除可抑制恶性胸膜间皮瘤细胞增殖，认为Bmal1基因在恶性胸膜间皮瘤发生发展中发挥促癌作用，可能成为其治疗靶点。HE等［26］在鼻咽癌研究中发现Bmal1 mRNA的表达水平与肿瘤远处转移有关。JUNG等［27］报道，Bmal1过表达可抑制肺癌和神经胶质瘤细胞的侵袭与转移，敲低Bmal1则促进其侵袭与转移；同时Bmal1敲低激活了PI3K/Akt/MMP2信号通路，而Bmal1过表达则可抑制该通路，认为Bmal1可能通过阻断PI3K/Akt/MMP2信号通路抑制癌细胞侵袭。MAZZOCCOLI等［32］认为在结直肠癌中Bmal1基因下调可能抑制肿瘤的生长和侵袭。此外，ZENG等［38］研究发现，下调Bmal1基因表达可加速体外实验细胞的增殖以及小鼠体内移植瘤的生长；抑制Bmal1在小鼠结肠癌细胞的表达，可减少依托泊苷诱导的细胞凋亡以及多西紫杉醇治疗后分布在G2/M期的细胞，同时减轻顺铂诱导的DNA损伤。综上认为，Bmal1可能发挥抑癌基因作用而抑制癌细胞生长和转移。

2.5 NPAS2基因

NPAS2基因又名MOP4基因，属于转录调节因子（basical helix-loop-helix-PAS，bHLH-PAS）家族。NPAS2基因定位于人类染色体2p11.2-2q13上，相对分子质量约为176.68 kb；NPAS2多肽链由622个氨基酸组成，位于N端的bHLH及PAS结构域可介导蛋白二聚体形成；C端由核受体连接区组成，介导NPAS2与核受体的衔接［39］。YANG 等［40］研究发现，与癌旁组织相比，新鲜结直肠癌组织中NPAS2表达水平降低，且与肿瘤大小、淋巴结转移及TNM分期有关，NPAS2表达低的患者肿瘤更大、淋巴结转移率更高，NPAS2表达水平高的患者5年生存率明显优于表达水平低的患者。XUE等［22］研究亦发现，结直肠癌患者肿瘤组织中NPAS2 mRNA表达水平较癌旁正常组织明显下调，NPAS2表达与肿瘤大小、TNM分期以及肿瘤远处转移呈正相关；沉默NPAS2基因可促进肿瘤细胞增殖与侵袭，同时增强伤口的愈合能力，说明在结直肠癌的发生发展中NPAS2可能是抑癌基因，可能抑制肿瘤转移，是潜在的预后预测指标。此外，YI等［41］对348例乳腺癌患者组织标本的NPAS2基因类型及表达水平进行分析，结果发现NPAS2表达水平高的患者无病生存期和总生存期明显改善，提示NPAS2在乳腺癌的发生发展及预后中发挥重要作用。

2.6 Tim基因

Tim基因的研究相对较晚，人类Tim基因位于第12号染色体上，长约43 kb，主要编码Tim蛋白，可与Per基因形成异二聚体［42］。Tim基因主要调节细胞增殖、代谢等活动。WANG等［33］研究发现Tim基因在直肠癌患者癌组织中的表达较癌旁正常组织明显升高，可能促进结直肠癌的发生以及淋巴结转移。ZHANG等［43］报道宫颈癌细胞株Tim基因的mRNA和蛋白表达水平异常，在宫颈癌组织中表达升高，且与患者年龄、临床分期、盆腔淋巴结转移、鳞状细胞癌抗原、肿瘤复发、肿瘤分级、手术切缘状况等有关，Tim基因上调与患者的总生存期和无病生存期较短有关。Tim基因在转移性前列腺癌移植瘤中的表达亦较正常前列腺组织高，且Tim基因高表达与患者淋巴结受累、高水平的前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen，PSA）等不良预后因素相关，认为Tim基因可促进前列腺癌转移，可能是转移驱动基因［44］。LIU 等［45］研究发现，Tim基因在鼻咽癌细胞株、新鲜冷冻和石蜡包埋的鼻咽癌组织中均表达上调，且与临床分期、肿瘤转移、血清EB病毒DNA水平等相关，其高表达还与患者较短的总生存期及无进展生存期有关，是无进展生存期及总生存期的独立影响因素。此外，该研究的体外及体内实验还表明Tim基因在鼻咽癌细胞中的异常高表达可抵抗顺铂诱导的细胞凋亡，从而促进上皮-间质转化表型，激活Wnt/β-catenin信号通路及其下游基因的转录；而敲低Tim基因则得到相反的结果，认为Tim基因可能促进鼻咽癌进展。由此可见Tim基因可能具有促进肿瘤发生及转移作用。

3 小结

时钟基因是生物体调控系统多反馈环的基本元件，在肿瘤侵袭与转移过程中发挥促癌和抑癌的双重作用。其中，Per1、Per2、Per3和NPAS2可抑制肿瘤转移，可能为抑癌基因；Clock、Cry1、Tim等可促进肿瘤的转移，可能为促癌基因；Bmal1基因在不同的肿瘤中发挥的作用不同，可能为抑癌基因或促癌基因；而其余时钟基因与肿瘤转移之间的关系则有待进一步研究。对时钟基因进行深入研究，将有助于揭示肿瘤侵袭与转移机制，从而更好地防治肿瘤转移，提高患者生存率。