弥漫大B细胞淋巴瘤分子通路研究及靶向治疗进展

何旭华

作者单位：27710，Durham，USA Division of Hematopahtology，Duke University School of Medicine；Duke Medical Center and Cancer Institute

弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuselargeB-celllymphoma，DLBCL）是最常见的淋巴瘤亚型，发病率占成人非霍奇金淋巴瘤的30%～40%［1］。根据基因表达谱分析，DLBCL可分为生发中心 B细胞样（germinal center B-cell-like，GCB）和活化B细胞样（activated B-cell-like，ABC）两个分子亚型［2］。利妥昔单抗联合CHOP（R-CHOP）作为一线治疗方案可以治愈约10%的DLBCL患者［3］，对于复发难治DLBCL患者，现有的挽救化疗方案联合自体造血干细胞仅可治愈约10%的患者［4］。如何提高余下30%患者的治疗疗效，是目前DLBCL治疗的难点。认识及研究DLBCL的发生发展机制有助于发现其潜在的治疗靶点及设计新的治疗方案。随着高通量测序平台的应用，越来越多涉及DLBCL发生发展的异常基因被发现，这些异常基因在分子通路中如何发挥调控作用也是DLBCL研究的热点。本文就目前DLBCL发生发展涉及的分子通路及相关靶向治疗研究进展作一述评。

1 DLBCL发生发展涉及的分子通路

1.1 B细胞受体信号通路

生理状态下，B细胞受体（B cell receptor，BCR）信号通路参与了正常B淋巴细胞的生长、发育及分化过程。BCR由识别及结合抗原的膜免疫球蛋白和传递抗原刺激信号的 Igα/Igβ（CD79A/CD79B）异二聚体组成。Igα/Igβ（CD79A/CD79B）胞内区含有免疫受体酪氨酸激活序列（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）。激活BCR通路主要有两种方式：一种是增强信号通路，该通路不依赖抗原刺激，主要通过PI3K/Akt通路维持静止期成熟B细胞的生存；另一种是抗原依赖的信号通路，经抗原刺激的B细胞发育分化主要通过该通路调节［5］。BCR结合抗原后，ITAM被SRC家族激酶磷酸化并激活脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，SYK），SYK活化下游的Bruton酪氨酸激酶（bruton tyrosine kinase，BTK）并激活磷脂酶 C-γ2（phospholipase C-γ2，PLC-γ2），而 PLC-γ2 可进一步活化CARD11/MALT1/BCL10（CBM）所形成的蛋白复合体及NF-κB通路，进而调节B细胞的生长发育［6］。在DLBCL细胞BCR信号通路的研究中发现，ABC亚型DLBCL细胞生长主要依赖于慢性激活信号通路。该通路类似正常B细胞的抗原依赖信号通路，与经抗原刺激的B细胞相关，依赖CARD11分子激活，主要诱导NF-κB通路活性。ABC亚型中ITAM的酪氨酸残基CD79B、CD79A的突变频率分别为20%、3%，而CD79B、CD79A突变可通过提高细胞表面IgM的表达，经PI3K和BTK传递信号激活NF-κB通路［7］。约10%的ABC亚型DLBCL存在CARD11突变，这可导致CARD11异常激活并直接活化NF-κB通路［8］。GCB亚型DLBCL细胞则主要依赖于增强信号通路。PI3K/Akt通路的异常激活是GCB亚型DLBCL细胞BCR信号通路活化异常的主要原因［9］。

1.2 Toll样受体信号通路

生理状态下，当抗原与Toll样受体（toll-like receptor signaling，TLR）的胞外区结合后，TLR先与MYD88结合，进而与白介素-1受体相关激酶（interleukin-1 receptor-associated kinase，IRAKs）形成复合物，激活包含NF-κB的下游通路，参与人体固有免疫、凋亡调控等。MYD88是TLR通路中关键的突变基因，其中第265位氨基酸的错义突变最常见，即亮氨酸错变为脯氨酸（L265P）。MYD88L265P突变可发生于30%的ABC亚型DLBCL，使其不依赖抗原刺激而直接引发IRAKs聚集、磷酸化，致使NF-κB和JAK-STAT3信号通路异常激活［10］。

1.3 BCL-2家族功能异常

BCL-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白及凋亡前体蛋白，在凋亡途径调节中扮演着极其重要的角色。B细胞淋巴瘤/白血病基因2（B cell lymphoma/leukemia 2，BCL-2）是重要的抗凋亡因子，持续的BCL-2激活可使生发中心B细胞逃避凋亡，从而导致肿瘤发生。DLBCL中BCL-2过表达涉及多种机制，其中以BCL-2基因易位最常见。约30%的GCB亚型DLBCL可检出染色体t（14；18）（q32；q21）易位，且该易位只发生于GCB亚型，BCL-2基因易位至免疫球蛋白重链基因增强子区域，使BCL-2 mRNA转录增加，从而导致BCL-2持续激活［11］。大约14%的ABC亚型DLBCL可检测到BCL-2基因拷贝数增加，而基因拷贝数增加引起BCL-2过表达通常只见于ABC亚型［12］。此外，发生于BCL-2基因启动子区和编码区的体细胞突变也与BCL-2持续激活有关，可见于35%的DLBCL且多为GCB 亚型［13］。

1.4 p53基因异常

p53是重要的抑癌基因，在细胞生长、凋亡和DNA修复等方面发挥重要的调控作用，p53失活可导致肿瘤发生。p53基因缺失或突变、多个基因及信号传导异常都可能引起p53转录、蛋白翻译水平及核定位异常，从而导致p53失活。8%～24%的DLBCL可检测到p53缺失，而p53缺失可引起p53 mRNA表达水平下降［14］。大约20%的DLBCL存在p53突变，突变主要位于p53第5～8外显子并干扰DNA结合基序，从而破坏p53介导的转录调节［15］。E3泛素连接酶MDM2、MDM4基因扩增可通过泛素化途径增强p53降解，降低p53在细胞核内积聚，从而降低其转录活性［16］。ATM基因通过磷酸化途径，CREBBP及EP300基因通过乙酰化途径调控p53转录后蛋白修饰，在DLBCL中可检测到ATM、CREBBP及EP300基因突变，其可导致p53蛋白功能异常［11］。

1.5 MYC基因异常

MYC基因是癌基因，可通过染色体异位、基因扩增、突变等形式活化，引起细胞DNA复制、核酸和蛋白的生物合成、细胞增殖等功能异常，导致淋巴瘤发生。染色体易位可导致MYC持续表达，见于4%～14%的DLBCL［17］。11%～30%的DLBCL可检测到MYC基因拷贝数增加，且导致MYC mRNA表达水平增高［18］。MYCT58突变可使MYC第58位苏氨酸磷酸化异常，影响MYC蛋白通过泛素化途径降解，从而增强MYC蛋白的稳定性［19］，导致MYC持续高水平表达。

1.6 组蛋白修饰异常

组蛋白修饰是表观遗传学研究的重要组成部分，是指组蛋白在相关酶的作用下，发生乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等修饰，继而改变染色质的状态，调控基因表达。近年研究发现组蛋白修饰异常也参与了DLBCL的发生发展。

DLBCL中组蛋白甲基化相关酶的表达异常或突变可引起组蛋白甲基化水平异常，导致基因转录调控失常。EZH2（Enhancer of zests homolog 2）基因编码的酶含SET结构域的赖氨酸转移酶，是多梳蛋白复合体的一个催化活性亚基。EZH2基因突变可见于约22%的DLBCL，且大多为GCB亚型。突变多位于SET结构域的Y641，可导致其编码的组蛋白甲基转移酶第641位酪氨酸改变为苯丙氨酸、天冬氨酸等。改变的蛋白使组蛋白H3第27位赖氨酸（H3K27）三甲基化异常，从而抑制细胞周期调控及浆细胞分化相关基因表达，引起细胞异常增殖、分化及增强侵袭性［20］。研究发现组蛋白乙酰化失衡与DLBCL的发生发展密切相关。组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase，HAT）CREBBP 和 EP300作为转录活化因子，可通过乙酰化修饰H3K27，发挥转录调控功能。约39%的DLBCL检出CREBBP和（或）EP300基因缺失和（或）突变，且其可使HAT编码结构域失活，进而导致B细胞发育、分化异常［21］。此外，CREBBP和（或）EP300基因缺陷导致的乙酰化异常，还可使BCL-6失活和p53功能丧失，进而参与DLBCL的发生发展［22］。

1.7 PD-1/PD-L1信号通路

程序性死亡受体-1（programmed death-1，PD-1）是存在于T细胞表面的一种抑制性受体，可与其配体程序性死亡配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）、PD-L2相互作用，抑制T细胞增殖、活化以及细胞因子分泌。在恶性肿瘤中，肿瘤细胞可通过上调PD-L1和PD-L2，并与T细胞表面的PD-1相互作用，抑制T细胞的活化与增殖，从而发生肿瘤免疫逃逸。对126例DLBCL患者的组织标本进行免疫组化检测，发现PD-L1表达于61.6%的瘤细胞，且与患者的无进展生存期及总生存期呈正相关，但PD-L1表达与预后无明显相关性［23］。大约27%的非GCB亚型DLBCL、6%的GCB亚型DLBCL可检测到PD-L1基因拷贝数增加及易位，这些基因异常与PD-L1高表达相关，从而导致肿瘤微环境中的T细胞耗竭［24］。

2 DLBCL靶向治疗进展

目前，已有许多针对DLBCL发病相关异常基因及信号通路研发的靶向药物，部分已正式获批进入临床应用，亦有许多靶向药物正在研发及临床试验阶段。

2.1 靶向BCR信号通路

BTK抑制剂Ibrutinib通过抑制BTK活性干扰包括NF-κB在内的多条信号通路而抑制瘤细胞生长。接受单药Ibrutinib治疗的复发难治ABC亚型DLBCL的疗效明显优于GCB亚型DLBCL（37%vs5%），尤其是合并MYD88L256P和CD79B突变的ABC亚型患者，有效率可以达到80%［25］。MYD88L256P和CD79B突变常见于原发中枢神经系统弥漫大B细胞淋巴瘤，单药Ibrutinib治疗的疗效可达77%～83%［26］。Ⅲ期随机对照试验PHOENIX研究比较了Ibrutinib联合R-CHOP及单用R-CHOP治疗初治非GCB亚型DLBCL的疗效，发现Ibrutinib联合R-CHOP可以提高60岁以下患者的无事件生存率、无进展生存率、总生存率，且耐受性良好，但60岁以上患者联用Ibrutinib导致治疗毒性增加，未能显示生存获益［27］。

2.2 靶向NF-κB信号通路

蛋白酶体抑制剂Bortezomib可以通过抑制IκB降解干扰NF-κB通路而发挥抗肿瘤活性。Bortezomib联合EPOCH方案治疗复发难治ABC亚型DLBCL患者的疗效优于GCB亚型［28］。但在随后的Bortezomib联合Rituximab、CTX、ADM、PDN作为一线方案治疗非GCB亚型患者的Ⅲ期随机对照试验中，联用Bortezomib未能明显改善非GCB亚型患者的预后［29］。免疫调节剂Lenalidomide具有直接抗肿瘤及免疫调节作用。Lenalidomide可与E3泛素连接酶cereblon蛋白结合，通过阻断NF-κB通路发挥抗肿瘤作用。无论是单用还是联合其他药物，在复发难治DLBCL患者的二线治疗中Lenalidomide均显示了良好的抗肿瘤活性作用，而且在非GCB亚型患者中疗效更好。REMARC研究是DLBCL维持治疗研究中第一个达到主要研究终点，实现PFS获益的随机对照试验，结果显示在60～80岁经一线治疗有效的初治DLBCL患者中，Lenalidomide维持治疗可提高患者的PFS，且PFS获益与细胞起源无关，提示Lenalidomide可能通过免疫调节机制而在维持治疗中发挥作用。2019年ICML大会公布了两项［30-31］Lenalidomide联合R-CHOP（R2CHOP）一线治疗初治ABC亚型DLBCL患者的临床试验结果。其中E2412研究是一项来自美国多中心的Ⅱ期临床试验，结果发现R2CHOP可以降低患者34%的进展或死亡风险［30］。ROBUST研究是首个在初治ABC亚型DLBCL患者中比较R2CHOP和R-CHOP一线治疗疗效的Ⅲ期全球多中心随机对照试验，但结果发现一线应用R2CHOP未能改善患者预后［31］。

2.3 BCL-2抑制剂

BCL-2抑制剂Venetoclax目前已进入临床，多项临床试验正在验证其治疗DLBCL的疗效。有研究发现单药Venetoclax治疗34例复发难治DLBCL患者，6例有效，其中4例获CR［32］。2018年ASH会议摘要公布了CAVALLI研究结果。CAVALLI研究是一项旨在评估Venetoclax联合R-CHOP一线治疗初治DLBCL患者有效性及安全性的Ⅱ期临床试验，与GOYA研究中使用R-CHOP的人群相比，免疫组织化学法检测BCL-2阳性，特别是经FISH检测证实存在BCL-2易位及“双打击”淋巴瘤的患者中，Venetoclax联合R-CHOP治疗的CR率优于单用R-CHOP，提示使用R-CHOP进行一线治疗时，在特定人群中选择性加用Venetoclax有望进一步改善患者预后［33］。

2.4 靶向p53通路

在APR-246的Ⅰ期临床试验中，纳入包括3例非霍奇金淋巴瘤在内的复发难治血液恶性肿瘤患者，结果发现部分患者的肿瘤细胞出现p53靶基因上调和细胞凋亡增加。但APR-246对DLBCL治疗是否有效尚需进一步验证［34］。干扰p53-MDM2信号通路可以修复MDM2介导的p53降解，从而提高p53的稳定性和表达。动物实验结果提示MDM2拮抗剂Idasanutlin联合Obinutuzumab、Venetoclax可显著提高DLBCL荷瘤小鼠的生存期［35］。目前Idasanutlin联合Rituximab、Venetoclax治疗复发难治DLBCL患者的临床试验（NCT03135262）正在进行。p53蛋白核定位正常是p53发挥正常转录活性的条件之一，XPO1（又称CRM1）是核输出蛋白受体importin β家族的重要成员，主要负责肿瘤抑制蛋白、生长调节蛋白如 p53、p21、PI3K/Akt、NF-κB 等的核输出。XPO1 抑制剂Selinexor通过抑制p53蛋白的核输出，从而恢复p53蛋白在核内的正常分布及功能。Ⅰ期临床试验结果显示，Selinexor治疗复发难治DLBCL患者，在41例可评价疗效的患者中13例获客观疗效，其中4例获 CR［36］。

2.5 Bromodomain抑制剂

溴结构域（Bromodomain）抑制剂Birabresib可以特异性结合到溴结构域和超末端结构（bromodomain and extraterminal domain，BET）的 BRD2、BRD3 区域，阻断MYC转录从而降低MYC表达水平。Ⅰ期临床试验结果表明，在17例可评价疗效的非白血病血液恶性肿瘤患者中，Birabresib单药治疗获CR 2例［37］。但在DLBCL中还需进一步评价Bromodomain抑制剂的疗效。

2.6 靶向表观遗传学通路

高选择性EZH2抑制剂Tazemetostat在EZH2野生型和EZH2突变型复发难治DLBCL患者治疗中显示了良好的有效性及安全性［38］。2018年ASH会议的一项摘要报道Tazemetostat联合R-CHOP一线治疗初治高危DLBCL患者，所有患者均完成计划的8周期治疗，疗效均达CR且耐受性良好［39］。在CREBBP突变的DLBCL中，组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂可恢复CREBBP及相关基因转录增强子区域组蛋白乙酰化水平，HDAC抑制剂Vorinostat单药治疗复发难治DLBCL有效率为18.9%，Mocetinostat联合利妥昔单抗、CTX、VP-16、PDN治疗老年复发难治DLBCL的有效率为35%［40］。MEF2B是组蛋白修饰酶之一。一项Panobinostat联合或不联合利妥昔单抗治疗复发难治DLBCL的Ⅱ期临床研究发现，检测到MEF2B基因突变的患者疗效明显优于未检出突变的患者（67%vs18%）［41］。

2.7 PD-1/PD-L1信号通路抑制剂

PD-1抗体Nivolumab在复发难治DLBCL患者中进行的Ⅰb期临床试验有效率为36%［42］，显示了令人鼓舞的疗效。但随后进行的Ⅱ期临床试验中，入组患者为自体造血干细胞移植治疗失败或不适合自体造血干细胞移植治疗的复发难治DLBCL患者，Nivolumab有效率仅分别为10%和3%。在该研究中，部分患者检测了9p24.1［PD-L1和（或）PD-L2］情况，发现只有16%的患者检测到低水平基因拷贝数增加，3%检测到基因扩增，认为PD-L1和（或）PD-L2基因拷贝数过低可能是Nivolumab疗效欠佳的原因［43］。KEYNOTE-013试验报道了Pembrolizumab单药治疗29例复发难治DLBCL患者的结果，发现PD-L1异常（包括拷贝数增加、扩增和易位）与疗效有关，具有和不具有以上PD-L1异常的患者Pembrolizumab治疗有效率分别为50%和9%［44］。这些研究结果说明PD-L1异常可能是预测PD-1抗体治疗DLBCL疗效的指标，值得进一步探讨。

3 小结

新的靶向药物在DLBCL患者治疗中显示了良好的应用前景，给复发难治DLBCL患者治疗带来了新的希望。但是这些新的靶向药物在临床试验或临床应用时还存在较多问题，如仅对部分患者有效，疗效持续时间有限等。因此，何种方法、何种分子指标识别靶向药治疗的有效人群；靶向药物治疗获得最佳疗效的阶段，是否联合治疗，或者与传统治疗手段联合，以及如何联合等，均是今后临床应用中需探索的问题。目前二代测序技术在寻找与DLBCL发病有关的异常基因及分子机制中发挥重要作用，将测序结果应用于患者的治疗疗效相关性分析、疗效监测、指导药物选择等研究亦已开展。DLBCL发生的机制研究虽然取得了较大进展，但仍有不明之处。目前即使发现了异常基因或分子通路异常，也还缺乏有效的方法解决。21世纪是精准治疗时代，进一步深入研究将有助于发现更多、更新、更理想的DLBCL精准治疗手段。