缺氧对恶性肿瘤血管生成拟态影响的研究进展

高聪, 付兆臣

1 恶性肿瘤中血管生成拟态的发现及特点

Maniotis等[1]在显微镜下观察到肿瘤中存在由肿瘤细胞形成的一些阿利新蓝-过碘酸-雪夫染色剂(Periodic acid-schiff stain,PAS)染色阳性的管道,并且在管腔中存在红细胞。通过透射电子显微镜、光学显微镜和血管内皮细胞标志物的免疫组织化学检测显示,管道的形成并不依赖于血管内皮细胞。因此,他们提出了一种独立于血管内皮细胞的新的肿瘤微循环模式,即血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)。

Racordon等[2]通过PAS染色发现VM从外观看是一种彼此关联的网络状结构,形态上有直的、弧形的、闭合环状的及网状的。管腔样结构内部由一层癌细胞及具有分泌功能的糖蛋白覆盖,含有丰富的基质蛋白,实性结构绝大部分为基质被覆的癌细胞。VM在形态上分成管道型和图案样基质型两种不同的类型。管道型VM与由内皮细胞衬里的血管相似,但在管道型的VM结构中未发现内皮细胞及其标记物;在形态上图案基质样VM跟由内皮细胞衬覆的血管相差大,是一种由富含基质蛋白的细胞外基质鞘形成的中空的、能够运输液体的网状结构,此种结构与内皮细胞衬覆的血管相连通,可形成输送血供的网络整体。

2 缺氧影响恶性肿瘤血管生成拟态的分子机制

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是血管生成的主要调控因子,其对血管内皮细胞起到特异性作用,促进内皮细胞的增殖和迁移[3]。VEGF也能刺激受体酪氨酸激酶恶性肿瘤的发展,通过氧含量影响肿瘤管道结构的形成。在恶性肿瘤快速生长的过程中,随着肿瘤体积的增加,内部可形成缺氧微环境,而缺氧可诱导肿瘤细胞基因型改变,显著增加其可塑性,并使血管内皮相关的细胞基因选择性表达,进而使肿瘤细胞能够作为血管内皮样的细胞形成VM。研究显示,在缺氧微环境下能刺激缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)1α的表达,而HIF-1α可以激活VEGF,研究显示,缺氧环(erythropoiethi-producing hep-atocellular,Eph)A2和血管上皮钙黏素(vascular endothelialin,VE-cadherin)蛋白的表达可促进VM的形成,并可促进肿瘤网状管道结构的形成[4]。Li等[5]在实验中证明VM 阳性表达的结直肠癌(colorectal cancer,CRC)中缺氧微环境诱导HIF-1α表达增加,HIF-1α促进表皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)相关的紧密连接蛋白4(claudin-4)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vim)等相关基因的表达,促进 EMT,而EMT表达增加CRC中VM的形成。

据报道,HIF-1α高表达可上调VM形成中关键基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2和MMP-9的表达。MMP是VM形成中的重要分子,可通过多种机制促进肿瘤细胞浸润和VM形成[6-7]。有学者将肿瘤细胞在氧气正常或缺氧状态下进行三维培养,结果发现,在缺氧状态下肿瘤细胞转化为内皮样细胞形成管道样结构,且与HIF-1α形成有关的信使RNA高度表达[8]。VE-cadherin/EphA2/磷酯酰肌醇3激酶(phosphinositide 3-kinase,PI3K)/MMP等信号通路被证实是血管生成拟态网络状结构形成的至关通路[9]。缺氧不仅可以激活HIF-1α,还可以激活HIF-2α。HIF-2α作为VM的起始分子,上调了VE-cadherin的转录,继而诱导EphA2重新定位到细胞膜,导致EphA2磷酸化,被激活的EphA2使局部黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)磷酸化,从而再激活细胞外信号调节激酶(extracellularsingal-regulated kinase 1 and 2,ERK1/2),进而激活PI3K，值得注意的是,PI3K能同时被VE-cadherin与EphA2激活。激活的PI3K调控膜型基质金属蛋白酶-1(membrane type 1 matrix metalloproteinase,MT1-MMP)前基因的激活,转换成MT1-MMP,从而激活MMP-2前基因。在MT1-MMP和MMP-2的共同作用下,促进了层黏连蛋白(laminin5γ25γ2,LN-5γ2)链裂解成片段,即5γ2和5γ2x片段,而细胞外微环境中这两个片段的数量增加最终导致了VM网络状结构的形成[10]。

3 受缺氧微环境影响VM的靶点分析

缺氧微环境影响下VM的靶点研究主要包括HIF-la特异性抑制剂的应用、沉默HIF-la基因、反义HIF-la质粒转染等[11-12]。俞旭君等[13]发现含有芪蓝胶囊药的血清可抑制前列腺癌PC-3细胞3D培养模型中VM的形成,其中中、高剂量抑制作用更明显。VEGF-α/EphA2/MMP1之间存在显著的上下游关系,即VEGF-α激活EphA2-MMP1,进一步有助于形成VM,由于三者是VM形成的重要起始因子,因此证实了该途径存在于VM的形成过程中。HIF-1α与VEGF-α和EphA2之间无明显抑制关系,其原因是其他因素对上游VEGF-α基因的调节作用。然而,沉默HIF-1α后,MMP-1的表达受到抑制,提示HIF-1α可能通过尚未知晓的其他途径抑制MMP-1的表达,从而影响VM的形成。前列腺癌组织中VM的表达在应用芪蓝胶囊后由于HIF-1α、VEGF-α、MMP-1基因和蛋白的表达受抑制而减少,进而减少了肿瘤组织的血液供应,最终在前列腺癌的治疗中发挥临床作用。HIF-1α是肿瘤微血管形成机制中的“中枢”,针对HIF-1α靶点的药物:如HIF-1α蛋白降解的分子伴侣Hsp90的抑制剂17-AAG和17-DMAG、HIF-1α蛋白翻译的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂托泊替康、拓扑异构酶Ⅱ抑制剂NSC644221、减少HIF-1α蛋白合成的哺乳动物雷帕霉素靶点(mammalian target of rapamycin,mTOR)抑制药雷帕霉素等,均可抑制肿瘤血管生成[14]。Cai等[15]发现替莫唑胺能够通过降低HIF-1α蛋白的表达,增强伊立替康的化疗作用。洋地黄药物地高辛可以抑制HIF-1α的活性,抑制肿瘤血管中血管的形成。低氧条件下在多种肿瘤细胞如喉癌、膀胱癌和胰腺癌中研究证实了四醇YC-1在肿瘤细胞缺氧条件下,对VM的形成具有一定的抑制作用。此外,还报道了参皂甙R93、2,甲氧雌二醇和拓扑异构酶Ⅱ抑制剂(MFTZ-1)对HIF-1α具有一定的抑制作用[16]。

4 缺氧微环境下几种肿瘤血管生成拟态的研究

4.1 缺氧影响脑胶质瘤VM的靶点研究 胶质细胞瘤恶性度高、预后差。脑胶质瘤的增殖必须要有足够的血液供应,但抗肿瘤血管生成疗法如抗VEGF药物在临床试验中并未达到预期治疗效果。王帆等[17]对胶质瘤组织进行CD34和PAS双重染色证实胶质瘤组织中存在VM。在研究期间证实,缺氧是形成胶质瘤VM的重要驱动因素之一,并且缺氧诱导了涉及VM的多种微小RNA。胶质瘤组织处于严重缺氧状态的微环境下可对肿瘤细胞中microRNA的表达产生负面影响。徐书刚等[18]最先发现microRNA-584-3p和microRNA-let-7f可显著抑制胶质瘤细胞中缺氧诱导的VM,骨膜成骨细胞特异性因子(Periostin,POSTN)成骨细胞及成骨细胞样细胞系分泌的一种胞外基质分泌性蛋白。研究表明,microRNA-let-7f通过调节POSTN可抑制人脑胶质瘤细胞中缺氧诱导的VM形成。此外,有研究显示肿瘤血管抑肽可以灭活肿瘤中的MMP2蛋白和抑制磷酸化EphA2蛋白，从而抑制胶质瘤中VM的产生[19]。在近年研究，低氧条件下胶质瘤细胞U87的细胞生长、血管生成,结果表明YC-1通过抑制HIF-1α的表达来抑制MMPs的表达,进而使U87细胞的血管生成减少[20]。

4.2 缺氧影响舌鳞状细胞癌VM的靶点研究 张劲涛等[21]建立裸鼠皮下移植瘤人舌鳞状细胞癌模型发现，沉默HIF-1α后移植瘤的生长速度变慢和体积显著变小,瘤体内的血管形态趋于正常并且微血管密度减小,VM现象少见,沉默HIF-1α后瘤体组织的VEGF、TGF-β1的表达显著减弱,提示口腔鳞癌移植瘤中VM现象的形成与HIF-1(及其对靶基因VEGF～TGF-1)的表达调控存在一定联系。最近有研究表明,存在EMT和VM的舌鳞状细胞癌具有更高的临床分期且更容易发生淋巴结转移,二者具有密切相关性[22]；同时,也有研究显示,TGF-β1、VEGF和MMP-2的表达与口腔鳞状细胞癌的浸润和转移有关[23]。

4.3 食管鳞癌VM在缺氧微环境下的研究 在消化道肿瘤中食管鳞癌较为常见,其晚期发展迅速,预后不良,这与肿瘤的血供密切相关。研究发现,当HIF-1α蛋白被破坏时,肿瘤中管状网络数量明显减少，VE-钙粘蛋白、epha2和ln5γ2的表达明显受到抑制,HIF-1α诱导血管钙粘蛋白表达进而诱导食管鳞状细胞癌细胞系Ec9706中血管生成拟态的形成[24]。在缺氧微环境中食管鳞状细胞癌细胞系Ec9706受Bcl-2-siRNA干扰后,VM相关的分子VE-cadherin和MMP2的表达明显受抑,VM生成明显减少,得知Bcl-2依赖的VE-cadherin高表达可能是缺氧诱导食管鳞癌细胞VM形成的重要分子机制[25]。

5 结论

缺氧是诱导恶性肿瘤VM形成的重要因素,对恶性肿瘤VM的形成具有促进作用,HIF-1α是恶性肿瘤VM形成的关键因子,且被认为是VM生成的始动因子,因此,以HIF-1α及VM为靶点设计抗肿瘤药物,有望达到抑制肿瘤细胞的生长及转移的目的,其中改变肿瘤缺氧微环境是潜在的治疗策略。我们相信随着研究的深入，缺氧微环境影响VM形成的机制研究将会更加清晰,将会推进抗肿瘤血管生成拟态药物的研制,这对提高恶性肿瘤的治愈率,延长患者的生命意义深远。