儿童慢性乙型肝炎患者HBV前C/基本核心启动子区基因变异特点研究

储 芳，钟彦伟，杨红艳，王 丹，温梦凡，刘 超，孙群兰，李 晶，张 明，官卉卉，王文波，张 敏

流行病学数据显示，我国1～59岁一般人群HBsAg携带率为7.18%，5岁以下儿童的HBsAg携带率为0.96%。婴幼儿时期感染者大约85%～95%不能清除病毒转为慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB）， 最终可发展至肝硬化（liver cirrosis, LC）、失代偿性肝病甚至肝细胞癌[1-2]。到目前为止，HBV的致病机制尚未完全清楚。国内外研究表明，乙型肝炎（乙肝）患者HBV前C（procore, PC）和基本核心启动子（basal core promoter, BCP）区变异与乙肝重症化进程相关[3-5]。但对儿童乙肝患者的研究鲜见报道。本研究探讨了儿童CHB患者HBV PC/BCP区变异的特点及临床特征。

1 对象与方法

1.1 对象 回顾性分析2006年1月—2013年12月在我中心就诊的病毒性乙肝患儿166例。年龄1～18岁，其中CHB患儿82例，乙肝相关LC患儿84例。所有病例诊断符合2015年《慢性乙型肝炎防治指南》，患者排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒及HIV感染，酒精，药物和自身免疫性肝病所导致的肝功能损害。样本使用标本库的标本。

1.2 HBV DNA的提取 在1.5 ml塑料离心管中加入200 μl患者血清；然后向上述离心管中加入600 μl病毒DNAout溶液，振荡30 s混匀后室温放置10 min；再振荡30 s混匀，加入700 μl异丙醇，振荡30 s混匀后，15 000×g室温离心15 min；移弃上清，加入1.0 ml 70%乙醇，振荡数秒后，15 000×g室温离心5 min；移弃上清，加入200 μl超纯水，用移液枪仔细吹打离心管管底和管壁的膜状沉淀，使其溶解。

1.3 血清学标志物及乙肝五项数据 采用患者入院当日采集血液样本并进行相关临床检测的数据。

1.4 HBV PC/BCP区扩增及序列测定 采用巢式PCR方法扩增HBV PC/BCP区序列[6]，PCR反应体系 25 μl。第一轮反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃35 s，59 ℃ 35 s，每2个循环温度降低2 ℃，72 ℃ 70 s；30个循环。第二轮反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 25 s，56 ℃ 25 s，72 ℃ 50 s；35个循环。PCR产物纯化后直接测序。使用Vector NTI 软件对测序结果进行分析。

1.5 统计学处理 用SPSS 19.0对数据进行分析。计量资料首先进行正态性和方差齐性检验，当数据符合正态性时，采用x±s表示；方差齐性时，组间比较用t检验，当方差不齐时，组间比较采用t’检验；当数据不符合正态性时，采用四分位数表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验。计数资料采用频数或率表示；当总样本量≥40且所有理论频数均≥5时，组间比较采用χ2检验；当总样本量≥40，但有1≤理论频数＜5时，组间比较采用连续校正χ2检验；当总样本量＜40，或有理论频数＜1时，组间比较采用Fisher确切概率法。所有统计分析过程均采取双侧检验。 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

166例患儿中，20.83%为感染HBV B基因型的患儿，79.17%为感染HBV C基因型的患儿。

从表1和表2可以看出，在感染B基因型的患儿中，CHB组和乙肝LC组患儿的ALT水平分别为（111.45±100.18）IU/L和（113.42±138.77）IU/L，2组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。但在感染C基因型的患儿中，CHB组和乙肝LC组患儿的ALT水平分别为（123.43±177.32）IU/L和（252.86±275.86）IU/L，2组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。

在感染HBV B基因型的患儿中，CHB组和乙肝LC组患儿相比，HBV DNA水平差异无统计学意义（P＞0.05），但后者的G1899A位点突变率高于前者（P＜0.05）。在感染HBV C基因型的患儿中，与CHB组患儿相比，乙肝LC组患儿的HBV DNA水平较低但ALT水平较高，差异均具有统计学意义（P均＜0.05）。乙肝LC组患儿发生A1762T、G1764A、G1896A基因位点的突变率明显高于CHB组患儿（P均＜0.05）。在感染HBV B和C基因型患儿中，CHB组和乙肝LC组患儿相比，基因位点G1752A、T1753C、T1758C、C1766T、T1768A及G1862T的突变率差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

表1 B基因型CHB和乙肝LC患儿检测结果Table 1 Serum examination results of genotype B children with CHB and LC

表2 C基因型CHB 和乙肝LC患儿检测结果Table 2 Serum examination results of genotype C children with CHB and LC

3 讨 论

HBV感染的结果取决于病毒、宿主免疫反应及环境因素之间的关系。当出现特殊的HBV变异打破三者之间的平衡，就会改变病毒与宿主之间的关系，引起肝细胞炎症，发生严重的肝脏疾病。目前，国内外文献对成人CHB患者HBV变异与乙肝重症化的相关性研究较多，通常认为HBV基因变异导致的病毒生物学特性改变是影响乙肝患者疾病进展的重要因素之一[7-13]。HBV PC/BCP区变异对HBV的复制和病毒蛋白的翻译可产生重要影响，进而影响疾病的进展[14-20]。但儿童乙肝患者相关问题的研究报道较少。本研究通过对儿童CHB和乙肝相关LC患者PC/BCP区变异特点及临床特征的比较，探讨二者之间的关系。血清检测结果显示：在感染B基因型的患儿中，CHB组与乙肝LC组患儿的ALT水平相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。但在感染C基因型的患儿中，CHB组与乙肝LC组患儿的ALT水平相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。

HBV PC区最常见的变异通常是1896位点变异，该位点变异可使色氨酸密码子（TGG）变为终止密码子（TAG），导致HBeAg合成终止。另外1862和1899位点变异可导致编码氨基酸改变，从而使HBeAg前体无法被信号酶裂解，对HBeAg的分泌造成影响。HBcAg是细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte, CTL）识别和攻击的主要靶抗原。当HBV PC/BCP区变异引起HBeAg缺失时，CTL对肝细胞的攻击活性增强，从而可引发肝脏免疫性损伤，导致肝脏炎症病变加剧，疾病重症化。此外，HBeAg的缺失还可以减弱CTL和Th1的活化诱导性细胞死亡，引起肝细胞大量死亡。HBV变异后往往引起抗原性和致病性改变，它既可使肝病加重，又可使病毒逃避机体免疫而持续感染。也有研究报道HBV BCP变异患者HBeAg表达水平降低，其原因为BCP变异可影响肝脏富集转录因子与BCP区的结合，使PC区mRNA转录明显减少，导致HBeAg合成减少[21-22]。最近有研究显示，T1753C、A1762T、G1764A、C1766T、T1768A、G1862T、G1896A 及 G1899A 位点的突变率随患者的肝脏炎症程度呈现上升趋势，表明这一区域多位点变异发生频率的增加与疾病重症化进程密切相关[23]。我们的研究结果显示感染HBV C基因型患儿，发生A1762T、G1764A、G1896A位点变异者，肝脏炎症程度呈现上升趋势，提示这些位点变异可能与乙肝相关LC密切相关。与西方国家乙肝以输血为主的水平传播方式不同，我国的CHB患者以母婴垂直传播为主，推测PC/BCP区变异可在长期的HBV感染过程中逐步积累，可能参与乙肝的致病机制。本研究结果对于阐明病毒学因素对儿童CHB患者结局的影响有重要意义。HBV感染的结果取决于病毒、宿主免疫反应及环境因素，当HBeAg合成或分泌障碍时，病毒与细胞间的平衡被打破，易引发宿主更强烈的免疫应答，导致更广泛的肝细胞损伤。本研究结果表明对CHB患儿开展A1762T、G1764A、G1896A位点突变监测具有重要意义。