健康成人肠道病毒71型 VP1和RdRp特异性T细胞免疫应答的初步研究

高 宁，李 梅，李亚萍，王文俊，贾晓黎，党双锁

人肠道病毒71型（enterovirus 71, EV71）能引发手足口病（hand foot and mouth disease,HFMD），以3岁以下婴幼儿发病为主[1]。成人大多通过隐性感染获得抗体，感染EV71后很少发病，但可成为传染源[2]。成人HFMD发病症状少见或是轻微与病毒感染后免疫功能较强有关[3-5]。我们前期研究结果显示EV71感染患儿的外周血T细胞存在结构蛋白VP1和非结构蛋白RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp）特异性细胞免疫应答反应[6]。目前有关成人EV71特异性T细胞免疫应答和免疫记忆的研究甚少。本研究通过检测40例健康成人VP1和RdRp抗原特异性CD4+和CD8+T细胞免疫反应，旨在初步阐述健康成人EV71 VP1和RdRp抗原特异性T细胞免疫反应的特点。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2012年8月于西安交通大学医学院第二附属医院进行健康体检（均签署知情同意书）的40例健康成人。其中男19例，女21例，年龄为21～65岁。入选标准：肝、肾功能正常，HBV、HCV血清学指标阴性，既往无过敏史，无自身免疫性疾病、肿瘤、免疫缺陷者，未使用激素和免疫抑制剂，近2周内无任何疾病和不适症状，无家族性疾病史及传染病史。

1.2 仪器与试剂 自动多肽合成机（MBS396，Advanced Chem Tech, Louisville, KY）；超净化工作台（苏州净化设备公司）；FACSCalibur流式细胞仪（BD公司）；ELISPOT 读板仪（德国AID公司）；RPMI 1640完全培养液购于美国GIBCO公司；淋巴细胞分离液均购于中国天津灏洋生物制品科技有限责任公司；植物血凝素（phytohemagglutinin, PHA）和胎牛血清购于美国Sigma公司；聚偏氟乙烯膜酶标板购于法国Millipore公司；IFN-γ 酶联免疫斑点分析法（IFN-γ enzyme-linked immunospot, IFN-γ ELISPOT）检测试剂盒、碱性磷酸酶标记的链霉亲和素均购于瑞典Mabtech公司；碱性磷酸酶显色剂购于美国Bio-Rad公司；抗-CD4和抗-CD8抗体包被的磁珠，磁力架（Dynabeads; Invitrogen）；FITC Mouse Anti-Human CD8和PE Mouse Anti-Human CD4购于美国BD公司。

1.3 方法

1.3.1 EV71 VP1和RdRp蛋白基因序列重叠肽库的建立 根据EV71/HubeiChina/2009病毒株（基因号GU434678.1）C4亚型VP1和RdRp蛋白氨基酸基因序列设计。通过生物信息技术设计并合成36条覆盖VP1蛋白和57条覆盖RdRp蛋白基因序列重叠多肽，重叠多肽由自动多肽合成机合成，其中每条多肽由15～20个氨基酸组成，相邻多肽间10个氨基酸重叠。

1.3.2 分离外周血单个核细胞及磁珠分选CD4+、CD8+T细胞 取肝素钠抗凝新鲜外周静脉血约20 m1，应用Ficoll密度梯度离心法分离获得外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）。采用阴性磁珠分选法，在PBMCs中分别加入结合磁珠的抗体，吸取获得不含有CD4+和CD8+T细胞的细胞，同时采用流式细胞方法检测CD4+、CD8+T细胞的纯度达98%以上，且验证发现 RdRp蛋白特异性T细胞总数与CD4+和CD8+T细胞之和的反应强度无差异。

1.3.3 体外IFN-γ ELISPOT法 包被：终浓度10 μg/ml抗人IFN-γ抗体包被96孔PVDF膜酶标板，4 ℃过夜。加样：分别加实验组重叠肽库5 μl（每条肽段终浓度为 2.5 g/ml）和 100 μl细胞 [（0.5 ～ 10）×105个细胞]，阳性对照组为同一细胞加PHA（终浓度为10 μg/ml）5 μl，阴性对照组为同一细胞加完全1640培养液 5 μl，置于 37 ℃、5%CO2孵箱中过夜（12～18 h）。显色：加入终浓度为1 μg/ml生物素标记的抗人INF-γ抗体100 μl，室温放置2 h；洗板，每孔加50 μl碱性磷酸酶标记的链霉亲和素（1∶1000），室温放置1 h，洗板后加50 μl/孔显色剂，反应孔出现蓝色斑点，终止反应。计数：读反应孔蓝色斑点数，每个斑点代表一个特异性T细胞，用斑点形成单位（spot forming units, SFUs）/106PBMCs来表示；设定反应孔内SFUs＞20个，并且＞3倍阴性对照孔SFUs为阳性反应判定标准。反应强度用每106个PBMCs中SFUs数表示；反应频率用反应阳性例数占全部例数的百分比表示。

2 结 果

2.1 RdRp蛋白肽库诱导产生T细胞免疫反应 采用体外IFN-γ ELISPOT技术，检测40例健康成人的EV71 VP1和RdRp蛋白肽库特异性T细胞产生的IFN-γ反应强度和阳性反应例数（即反应频率）。结果显示12例（30%）健康成人检测到RdRp蛋白肽库特异性T细胞免疫应答反应，反应强度中位数为64.00 SFUs/106PBMCs；而未检测到VP1蛋白肽库特异性T细胞免疫应答（见图1、2）。

图1 同一个体对EV71 VP1和RdRp肽段的T细胞反应Figure 1 Comparison of T cell response to EV71 VP1 and RdRp peptides in one adult

2.2 RdRp蛋白特异性CD4+、CD8+T细胞反应 为进一步区分RdRp蛋白特异性CD4+、CD8+T细胞反应，采用磁珠分选法获取存在RdRp蛋白特异性T细胞免疫反应个体的CD4+T细胞（即去除CD8 T细胞）和CD8+T细胞（即去除CD4 T细胞），再次通过体外IFN-γ ELISPOT技术检测CD4+和CD8+T细胞反应强度。结果显示CD4+T细胞参与RdRp蛋白特异性细胞免疫应答（见图3）。

图2 EV71 RdRp特异性T细胞应答强度个体分布Figure 2 Distribution of T cell responses specific for EV71 RdRp protein in each subject

图3 同一个体体外IFN-γ ELISPOT检测RdRp特异性CD4+ 和CD8+ T细胞反应Figure 3 Ex vivo IFN-γ ELISPOT detection of RdRp specific CD4+ and CD8+ T cell response in one adult

2.3 RdRp蛋白特异性T细胞表位筛选 为找出RdRp蛋白区诱导产生细胞反应的重叠肽段，进行了相应的T细胞表位筛选。将覆盖RdRp蛋白基因序列的57条重叠肽段分为3组肽库矩阵，RdRppool 1：RdRp1～18（第1732～1885位氨基酸）；RdRp-pool 2：RdRp19～36（第1886～2029位氨基酸）；RdRp-pool 3：RdRp37～57（第2030～2193位氨基酸），首先利用3组肽库进行初步筛选，然后对反应阳性的肽库进行确认实验，分别用这3组肽库体外刺激已知12例存在RdRp蛋白特异性T细胞免疫应答阳性的个体，发现均可检测到一组或更多组RdRp肽库特异性T细胞反应，表明RdRp蛋白具有多个T细胞表位，不同个体识别表位可能与其人类白细胞抗原表型差别有关（见表1）。

表1 EV71 RdRp肽库中含有的T 细胞表位Table 1 EV71 RdRp peptides containing T cell epitope

3 讨 论

本研究选取EV71 VP1和RdRp作为研究靶蛋白，其中VP1是EV71中和决定子，直接决定病毒的抗原性[7-8]；RdRp高度保守是病毒复制的关键酶[9-10]。既往动物实验表明，编码VP1的DNA疫苗能诱导特异性T细胞免疫反应[11]。我们前期研究也显示VP1和RdRp均可诱导EV71感染患儿T细胞免疫应答反应[6]。成人感染EV71后发病非常少见，往往作为病毒携带者和传染源[12]。台湾一项关于家庭内密切接触传染的前瞻性队列研究发现，每个HFMD患儿家庭中至少有一个成员有EV71感染，所有成员中52%感染EV71，其中成人为38%[13]。对EV71完全具有免疫力的成人也有超过16%没有抗EV71中和抗体[14]，细胞免疫反应在疾病发生发展中起重要作用。而在对EV71隐性感染者，特别是对健康成人中EV71特异性T细胞免疫反应的研究尚为空白。

本研究选取40例健康成人作为研究对象，通过重叠肽技术合成覆盖EV71 C4亚型结构蛋白VP1和非结构蛋白RdRp重叠肽段作为抗原，采用IFN-γ ELISPOT和磁珠分选法进行检测，结果显示有12例（30%）健康成人检测到RdRp蛋白特异性T细胞反应，RdRp蛋白诱导的T细胞免疫应答以特异性CD4+T细胞为主；而未检测到VP1特异性T细胞免疫应答。健康成人外周血检测到EV71 RdRp蛋白特异性T细胞免疫反应，提示这部分健康成人为EV71隐性感染或是既往感染后机体保留的免疫记忆，但是维持多久有待进一步研究。

本研究中还鉴定了9个EV71 RdRp蛋白的T细胞表位。这些单个重叠肽段同时可以诱导产生CD4+T细胞免疫应答，说明CD4+T细胞能够识别RdRp抗原表位。本实验对健康成人外周血VP1和RdRp蛋白存在特异性T细胞免疫应答的初步探讨提示：①RdRp特异性T细胞免疫应答在健康成人个体中存在阳性反应，但未检测到VP1特异性T细胞免疫应答；②健康成人RdRp特异性T细胞免疫应答以CD4+T细胞免疫应答为主；③健康成人外周血存在特异性CD4+T细胞，可能存在EV71隐性感染或与其他肠道病毒存在交叉抗原表位；④健康成人外周血中可能存在RdRp蛋白肽库特异性记忆T细胞，并在体内长期维持记忆功能。该研究有助于指导控制EV71的流行，阐明EV71的细胞免疫应答机制，为EV71感染防控提供重要的理论依据。

志谢感谢英国牛津大学分子医学研究所人类免疫中心Tao Dong教授对本实验给予的指导