矿泉水中铜绿假单胞菌检测能力验证结果评价

◎ 杨秋玲，季婧涵，黄小方，林晓娟

（南平市食品药品检验检测中心，福建 南平 353000）

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aernginosa）又称绿脓杆菌，是一种常见的食源性和水源性致病菌，它极易在水中及含水量较高的食品中存活并繁殖，对消毒剂、紫外线等理化因素具有很强的抵抗力，可引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症和皮肤炎症等疾病[1-3]。因此，准确而快速地检出铜绿假单胞菌，在保障人民饮食用水安全和评价检验检测机构检验能力方面就显得尤为重要。能力验证是一种有效确认实验室内部质量控制的方法，同时对检测人员技术水平的提高和质量管理体系的完善起到积极的作用[4]。目前，铜绿假单胞菌的检测主要采用国标法，检测时间至少2 d，且对操作人员的技术要求很高，不利于快速检测。近年来，随着分子生物学的快速发展，实时荧光定量PCR由于检测时间短、操作简单、且特异性强等优势而被广泛的运用于病毒和食源性致病菌的检测。参加本次能力验证旨在通过对铜绿假单胞菌的检测，确定本实验室具备检测该菌的能力，同时通过对比分析实时荧光定量PCR法以及国标法的检测结果，为今后水中铜绿假单胞菌的快速、高效、准确检测提供有价值的参考和借鉴。

1 材料与方法

1.1 样品来源和标准菌株

样品18-U262和样品18-N396，由中国检验检疫科学研究测试评价中心提供。标准菌株铜绿假单胞菌（FSCC 206004）和荧光假单胞菌（GDMCC1.344），均从广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心购买。

1.2 主要仪器

CFX96-Touch Deep WellTM实时荧光定量PCR仪、Centrifuge 5418台式离心机、CHB-T2-B恒温金属浴、ND-ONE-W超微量分光光度计、2018614涡旋混合器、SHP-350生化培养箱、G154DW立式自动压力蒸汽灭菌器、HTY-305G微生物限度检验仪、ZF-1三用紫外分析仪以及AC2-4S1生物安全柜等。

1.3 主要试剂

绿脓杆菌核酸测定试剂盒，购自上海之江生物科技股份有限公司；营养肉汤、CN琼脂及配套试剂、绿脓菌素测定培养基等，购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.4 样品的制备

将样品用520 mL无菌水再水化，制成待测样品原液。取待测样品原液60 mL加入到540 mL的无菌水中制成1∶10的样品匀液；按相同的方法制备1∶100、1∶1 000的样品匀液，备用。

1.5 铜绿假单胞菌的实时荧光定量PCR法

取25 mL待测样品原液通过孔径0.45 μm的滤膜过滤，将滤膜转移至100 mL营养肉汤中，增菌18 h后，取增菌液1.5 mL，13 000 r·min-1离心2 min；弃上清液，沉淀中直接加入100 μL DNA提取液充分混匀，沸水浴10 min。13 000 r·min-1离心5 min，取上清液备用。DNA的扩增根据上海之江生物科技股份有限公司绿脓杆菌核酸测定试剂盒（荧光PCR法）的说明书进行。

1.6 铜绿假单胞菌的国标法

根据GB 8538-2016 食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法的铜绿假单胞菌-滤膜法，将250 mL水样或稀释液通过孔径0.45 μm的滤膜过滤，然后将滤膜平铺在制备好的CN琼脂平板上,将平板倒置于36 ℃培养24～48 h，观察结果；同时做阳性和阴性对照[5]。

2 结果与分析

2.1 实时荧光定量PCR法检测结果

用实时荧光定量PCR法检测2份待测样，结果2份待测样品均检出铜绿假单胞菌，结果如图1所示。从图1可以看出，样品18-U262和样品18-N396的样品经过PCR扩增出的曲线和内部阳性对照样的曲线一致，FAM通道的Ct值均≤35，说明检测结果阳性。

图1 样品18-U262和样品18-N396实时荧光定量PCR结果图

2.2 国家标准法检测结果

按国家标准GB 8538-2016法对2份待测样品进行检测，结果在CN平板上的菌落形态如下：阳性对照组有蓝绿色菌落生长，阴性对照组有黄绿色菌落生长；样品18-U262和样品18-N396的样品有蓝绿色菌落和其他菌落生长，挑取蓝绿色菌落，通过绿脓菌素试验，被检物里面均存在绿脓菌素，判定检测结果阳性，计数所有蓝绿色菌落，结果见表1。样品18-U262的报出值为4 600 CFU/250 mL，样品18-N396的报出值为2 200 CFU/250 mL。

表1 CN平板上的铜绿假单胞菌菌落数表

3 结论

本实验室通过参加由中国检验检疫科学研究院测试评价中心组织和负责实施的对2份矿泉水盲样中铜绿假单胞菌的检测能力验证，样品18-U262的检测结果为4 600 CFU/250 mL，样品18-N396的检测结果为2 200 CFU/250 mL，评价中心按照ISO 13528-2015标准，利用参加实验室的结果计算了能力评价统计量得出本次试验的Z值分别为0.5和0.3，能力评价准则结果|Z|均小于2，评价结果满意，说明本实验室具有检验该菌的能力。

在本实验中，实时荧光定量PCR法与国标法对铜绿假单胞菌的检出结果皆为阳性，该方法与传统国标法相比具有取样量小，检测时间短、操作简单等优点，因此，可将qPCR法辅助国标法对水中的铜绿假单胞菌进行快速检测和结果初筛，提高其检测效率，同时也为其他微生物的快速、高效、准确的检测提供有价值的参考和借鉴。