MoFlo XDP超速流式细胞分选仪的管理及维护*

陈云凤 龙 钊 王晓红 许佳玲 罗剑文 张以顺*

流式细胞分选仪可对快速、直线及流动状态中的单个细胞或其他微粒进行逐个、多参数和快速定性定量分析，同时可对特定群体精确识别并分离的现代细胞分析技术设备[1-3]。MoFlo XDP超速流式细胞分选仪(美国Beckman Coulter公司)是细胞生物学、单克隆抗体技术、激光技术、流体力学、电子计算机等学科高度融合发展的结晶[4-6]。流式细胞技术已被广泛应用于细胞生物学、肿瘤学、免疫学、血液学、病理学、临床检验、药理学、农业及畜牧业等领域[7-11]。

流式细胞分选技术具有高通量、分选速度快、分选细胞纯度高和活性好等技术优势，但当分选前调校和操作较为复杂费时，如果分选的每个步骤操作不当或仪器参数设置不准确，则会对分选出目标细胞的活性、纯度、得率和分选速度有较大影响，甚至缩短仪器的使用寿命[12]。为此，本研究对中山大学生物学国家实验教学示范中心使用7年的MoFlo XDP超速流式细胞分选仪管理方法进行探讨。

1 MoFlo XDP超速流式细胞分选仪的管理

1.1 实验室环境

流式细胞分选仪的性能和使用寿命受环境温度、湿度及清洁度等方面的影响。流式细胞分选仪室必须是一个全密封的环境，配有冷暖空调、紫外灯和抽湿机，应具有配备冷暖空调、紫外消毒的缓冲间，防止污染。真空泵和压缩机置于缓冲间，可减少流式细胞仪室的噪音。

1.2 仪器管理员

大型科研设备的管理实行专管共用原则，集中于实验教学中心，实行校内外共享服务，由专职仪器管理员进行仪器的操作和日常维护[13-14]。专职管理员于实验前介入师生的相关实验内容，阅读相关资料，结合自己的操作经验，指导师生完善实验样品制备和实验方案设计，确保师生的实验顺利完成。

流式细胞分选仪的开机、调节和关机必须由管理员完成。流式细胞分选仪的光路和流路比较复杂，滤光片很灵敏，滤光片位置一点点变化就会引起光路很大偏差[15]。管理员具备熟练的操作方法，可在短时间内把光路和流路调好。如果让师生完成这些工作，可能出现：①光路偏离太多，需要管理员或工程师花很长时间才能矫正；②调节旋钮的螺纹滑丝，影响光路和流路的精确性；③因忘记关激光、压缩机等而降低仪器的性能和缩短使用寿命。

1.3 培训与交流

(1)管理员培训与交流。学院对大型科研设备管理员的技术培训与交流主要采取送出去和请进来两种方式。每年学院利用学校给予的政策与经费支持，有针对性地安排相关设备管理员到国内外高校和仪器公司进行参观、学习和交流[13]。并邀请仪器生产厂家的专业技术人员到学院仪器现场开展定向培训。

(2)师生培训与交流。使用流式细胞分选仪的师生需要对其原理、性能及适用范围等有个大概的认知，才能针对不同的实验材料采取最适合的实验技术和方案。

(3)师生主动提前介入。将流式细胞术的基本原理和应用纳入一年级本科生和研究生的《生物学仪器设备技术》课程。同时，邀请专家和工程师给师生们开展实验技术及应用交流讨论。

(4)管理员与师生合作交流。由于实验教学中心的大型仪器都是实行校内外共享，师生需要在网上预约和经过上机培训后才能使用仪器[13]。仪器管理员与使用师生之间只有保持高度默契的合作交流，才能确保仪器的正常运行和取得好的实验结果。

2 MoFlo XDP超速流式细胞分选仪操作维护技巧

管理员在操作流式细胞分选仪时，要善于观察，总结操作经验和技巧。仪器最佳条件的设定和参数的调试直接关系到分析的精确度和分选的产率、纯度及活力等结果[16]；正确的操作经验和技巧是为了维持仪器的良好性能和延长仪器的使用寿命。

2.1 开机

开机前不需要每次更换喷嘴(cyto nozzle)，尽量减少喷嘴的更换次数来保护喷嘴固定器的螺纹。开机后需要等流路冲洗干净和激光达到稳定时才能调流路和光路，增加其精确性。

2.2 流路调节

调流路前必须排气泡，气泡会严重影响智能分选模式的稳定。通常要上下移动多次喷嘴才能将流路调正，所以要观察喷嘴在最低和最高时千分尺的位置，避免调得过低或过高造成螺纹滑丝和流动室组件脱落。喷嘴降到最低处时，千分尺的刻度通常在5以上2～3格；喷嘴升到最高处时，千分尺的刻度通常在15以上1～2格(如图1所示)。

喷嘴位于最低处时，小孔(pin hole)应调在液流最中间；喷嘴位于最高处时，如果液流偏小孔太多，要将液流调至偏向相反一侧。这样可以减少喷嘴上下移动次数， 更快调正液流和减少螺纹的磨损(如图2所示)。

图1 调液流时喷嘴的位置示图

图2 液流调节示图

2.3 光路调节

(1)用荧光微球调光路时，如果发现上样细胞数值为0，原因可能有未开激光、样品压力低于鞘液压力、光路未调好、流路堵塞及阈值设置不好；如果发现上样细胞数值很大，原因可能有前向散射光(forward scatter，FSC)未调好、流路堵塞了和面板上FSC阈值被改变为其他通道阈值。

(2)多激光检测时，要先调好蓝激光通道的变异系数(coefficient of variance，CV)值(如图3所示)。①先调液流组的微调千分尺的左右键和聚焦键，两个键轮流调，把光斑调至最上、最右且最聚集，当发现光斑由不均一的红色和黄色混合的射线(图3-A)突然变成聚集的黄色斑点(图3-B)时，再调激光组；②调激光组时，一般只调上下和前后的微调千分尺，聚焦千分尺影响较小；③蓝激光调好后，再调其他激光的通道；④若每次实验把喷嘴降低到相同位置，其他激光的光路常不需要调节CV值即可＜3%。

图3 光路调节示图

(3)由于滤光片比较灵敏，如果能通过以上流路和光路调节得到理想的CV值，则不要调滤光片，否则要花更多的时间去矫正光路。

2.4 智能分选模式(IntelliSort State)的建立

(1)为防止样品污染，建立智能分选模式前，用75%的乙醇高速上样5 min对流路进行消毒，再用无菌水高速上样5 min。

(2)调Charge Phase(充电相位)和分选时，电极板会出现加电不正常，液滴在电极板之间来回运动，最终影响智能分选模式的建立和降低分选纯度。最佳的纠正方法是：①用蒸馏水冲洗电极板上的结晶盐，用无屑纸擦干净后再装上；②调Charge Phase时电压不要超过2700 V；③目的细胞含量高时，降低电压使偏转液流远离偏转板，或者将样品稀释使偏转液流变细。

(3)理想的分选模式为：①最后一个连接液滴被粗细均匀的卫星液滴挂住；②最后一个连接液滴与断开液滴之间的卫星液滴呈粗细均匀的直线，位于两个液滴中间；③对于100 nm的喷嘴，Maintaining(智能分选模式的维持)的指示线一直保持在最高点。分选模式如图4所示。

图4 理想的智能分选模式(IntelliSort State)示图

2.5 检测和分选

(1)检测。先检查样品的质量状况，样品若带有培养基、未过滤或细胞凝聚成团会堵塞流路。

(2)分选。上样、分析和分选操作，经过管理人员多次培训后由使用师生独立完成。对师生要进行以下操作和注意事项培训：①用75%酒精棉球擦拭分选窗，防止样品污染；②为保持智能分选模式的稳定，要等上样准备就绪，发现有稳定的每秒细胞数(events per second， EPS)时，才开启电脑上的分选，反之，要先停止电脑上的分选，才能在面板上操作暂停或停止上样；③上样和停止上样是同一个按钮，所以只能按一次按钮，耐心等待上样器的开门和关门，如果连续按两次或更多次，上样器的门会开了又关，同时上样针会上升了又下降，这时候取样品可能会造成上样针和上样器损坏，还可能引起手受伤事故；④面板上出现对话提示框，当智能分选模式已不能维持，应立即停止分选，避免目的细胞的分选纯度受影响；⑤如发现EPS越来越少，可能是待分选样品沉底或聚集了，应停止分选，混匀后再上样分选；⑥如出现EPS越来越多，这时流路开始堵塞，应立即停止分选，用无菌水高速上样冲洗，及时发现这种情况并冲洗流路可防止流路严重堵塞甚至损坏；⑦要留意样品的液面高度，切勿让上样针露出液面吸入气泡而影响智能分选模式的稳定。

2.6 关机

(1)为了更好地维护和保证流式细胞分选仪下次实验能顺利进行，需由管理员完成关机。防止流路堵塞和提高仪器的使用效率的方法有：①高速冲洗流路，用1%次氯酸钠洗涤前需用无菌水冲洗，尽量把流路中残留的细胞冲洗掉，如果直接用1%次氯酸钠冲洗，会造成太多细胞在流路中破裂，细胞碎片在流路中积累越来越多而堵塞流路；②每次实验后加满鞘液，鞘液经静置后可以减少气泡。

(2)延长仪器使用寿命的注意事项有：①先将激光锁匙旋到关闭，使激光慢慢降温，15 min后关闭激光电源，可延长激光的寿命；②关闭液流显示灯，可延长灯泡寿命。

3 MoFlo XDP超速流式细胞分选仪管理效果

通过对MoFlo XDP超速流式细胞分选仪的管理与维护取得了较好的效果，从实验室环境、仪器管理员、培训与交流等方面积累了丰富的管理和维护经验。近年来，仪器公司多次组织相关部门的流式细胞仪操作者来学院进行培训。通过管理和维护，MoFlo XDP超速流式细胞分选仪使用机时超过10000 h，从未出现过流路严重堵塞、样品污染等不良现象，仍然保持良好的分选效率，分选纯度仍保持在99%以上，并延长了设备的使用寿命。

4 结语

流式细胞分选仪是多门学科综合的结晶，被广泛应用于生物学、医学等领域，管理和维护以及更好地开发利用流式细胞分选仪的功能，是管理员需要继续深入研究的课题。流式细胞分选仪管理员和科研人员需要不断地有意识地学习各门相关学科知识，以便更好地将流式细胞分选仪应用到各学科的教学和科研中。