结直肠癌细胞放疗增敏的研究进展*

刘馨元 综述，刘珊，蒋永新 审校

650118 昆明,昆明医科大学第三附属医院·云南省肿瘤医院 肿瘤研究所

2015 中国癌症统计数据显示：我国结直肠癌(colorectal cancer，CRC)发病率、死亡率在全部恶性肿瘤中均位居第5位，其中新发病例37.6万，死亡病例19.1万[1]。手术切除是I期直肠癌最常见的治疗方法，其中约一半患者同时也接受放射治疗和(或)化疗; Ⅱ期和Ⅲ期患者通常采用新辅助化疗加放射治疗；Ⅳ期患者化疗是其主要的治疗方式[2]。放疗虽然目前在结肠癌治疗中应用较少，但最新研究发现术后辅助放化疗较术后辅助化疗可提高T4期结肠腺癌患者局控率和无病生存[3]。肿瘤细胞的异质性决定了不同个体肿瘤患者用相同放疗剂量和分割模式所获得的治疗反应存在一定的差异[4]，放疗后肿瘤的局部复发在不同个体中情况各异[5-6]，提示我们不同肿瘤患者对放射治疗的敏感性存在显著差异。因此，探索增加CRC对放射的敏感性是我们现在急需解决的问题。

肿瘤细胞对放射的敏感性降低是由各种途径诱导的，包括缺氧，受体酪氨酸激酶/蛋白激酶B(RTK/AKT)，DNA损伤修复，粘附途径，炎症和发育途径[7-9]。本文将从DNA损伤修复、细胞周期、细胞凋亡和肿瘤微环境4个方面综述CRC放疗增敏相关的最新研究进展。

1 抑制DNA损伤修复

电离辐射(ionizing radiation,IR)主要是通过使细胞核DNA双链断裂(double-strand breaks, DSBs)来杀死肿瘤细胞。细胞受到非致死性放射剂量照射后，可以通过自身修复机制来修复放射损伤，肿瘤细胞的DNA修复能力增强有助于癌细胞获得放疗抗性[10], 近期一些研究发现，西地兰、HSP90(heat shock protein 90)抑制剂NW457和索拉非尼增加CRC细胞的放疗敏感性都是通过抑制CRC细胞的DNA损伤修复来实现的[11-13]，提示我们将DNA修复抑制药物与放射治疗联合应用可以提高患者治愈率和改善患者预后。

DSBs通过两种途径修复：同源重组(homologous recombination，HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)，其中NHEJ在整个细胞周期中都发挥重要作用，是 DSBs修复的主要方式[14]，5-FU与IR联用可以由Tat-结合蛋白1(Tat-binding Protein 1,TBP1)通过泛素依赖性和蛋白酶依赖性途径来减少烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的组蛋白去乙酰化酶7(NAD+-dependent deacetylase sirtuin-7,SIRT7)的表达，增加CRC细胞的凋亡[15]，而SIRT7缺陷的细胞表现出NHEJ受损并对DNA损伤的易感性增加[16-17]，最新的研究发现了一种新的SIRT7抑制剂(ID：97491)以剂量依赖性方式降低SIRT7活性[18]，为我们提供了通过下调SIRT7的表达来增加CRC放疗敏感性的新思路。

在NHEJ过程中，Ku异二聚体 (Ku70/Ku80)和DNA依赖性蛋白激酶催化亚基(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)组成的DNA-PK复合物Ku70/80异二聚体识别DSBs，然后招募X射线交叉补体蛋白4(X-ray cross-complement protein 4, XRCC4)、XRCC4样因子(XRCC4-like factor, XLF)、XRCC4和XLF的旁系同源物(paralogue of XRCC4 and XLF, PAXX)和DNA连接酶Ⅳ(DNA ligase Ⅳ,LIG4)一起共同完成DSB末端连接[19-20]，有研究发现Wnt信号通路通过β-catenin反式激活LIG4，增强CRC细胞中的NHEJ使其具有放射抗性，降低LIG4的表达后CRC放射敏感性明显得到增强[21]。姜黄素可以通过上调XRCC5、CCNH和下调LIG4、多聚核苷酸激酶磷酸酶(polynucleotide-kinase phosphatase, PNKP)的表达来增强结肠癌HT-29细胞的放疗敏感性[22]。因此，LIG4可能成为CRC放疗增敏新的靶标。

共济失调毛细血管扩张突变(ataxia telangiectasia mutated, ATM)蛋白激酶和DNA-PKcs均属于磷脂酰肌醇-3-激酶样激酶(phosphatidylinositol-3-kinase-like kinase,PIKK)家族[23]。DNA-PKcs在NHEJ途径中发挥重要作用，ATM则能促进HR过程[24]，Wang等[25]研究发现XRRA1(X-ray radiation resistance associated 1)所涉及的DNA损伤修复介导的放化疗抵抗是通过调节ATM/CHK1/2途径来实现的。最新的研究[26]表明，DNA-PKcs通过磷酸化ATM激酶抑制ATM的催化活性，进而负调控HR，综上，同时对NHEJ和HR进行负调控是增强CRC放射敏感性的重要手段。

2 影响细胞周期动力学

细胞周期阻滞是机体对电离辐射的一种保护性反应，细胞受电离辐射损伤后，产生细胞周期阻滞，使细胞有足够的时间进行自我修复、逃避放射性损伤，从而表现出放疗抵抗。在分裂周期不同时相的细胞对放射杀灭的敏感性不一，对放射最敏感的是M期细胞，G2期细胞也较敏感；G1早期细胞相对敏感，随着G1逐步向S期发展，放射敏感性也随之降低，至G1后期已呈相对抵抗，S期对放射呈抵抗性[27]。如何利用放射增敏剂将细胞停滞于对放射敏感的周期来逆转CRC细胞的放疗抗性成为当下的研究热点，近来有研究表明，甲壳寡糖、二甲双胍和IR联用均可将CRC停滞于对辐射敏感的G2/M期[28-29]，增强IR对CRC细胞的疗效。当前p53与视网膜母细胞瘤肿瘤抑制蛋白(retinoblastoma tumor suppressor protein family,Rb)关于细胞周期阻滞的研究取得了新的进展，有望为今后放射增敏的深入研究提供新的依据：

2.1 p53对细胞周期的阻滞作用

肿瘤抑制基因p53在人类细胞周期G1检测点起着关键性的作用，先前的研究表明表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂盐酸埃克替尼通过增加p53结合蛋白1(p53 binding protein 1,53BP1)的表达增强CRC细胞对放疗的敏感性[30]，进一步机制研究发现53BP1可能是通过影响ATM-CHK2-p53信号通路将肿瘤细胞阻滞在S期[31]。DNA损伤检测点除了p53依赖机制还有p53非依赖机制，比如IMP1338，一种新型蒽醌衍生物，将CRC细胞阻滞于G2/M期就是通过p53非依赖途径[32]。

2.2 Rb对细胞周期的调控作用

Rb蛋白是细胞周期的重要调控者，可将细胞阻滞在G1期，通过诱导细胞老化现象抑制肿瘤细胞的增殖。研究发现放疗后的CRC细胞中miR-622的表达上调，其通过直接靶向Rb的 mRNA的3′UTR来抑制Rb蛋白的表达，引起癌细胞放疗抗性，进一步实验显示过表达Rb可逆转体外miR-622诱导的癌细胞放射抗性[33]，提示我们CRC的放疗增敏可以通过上调Rb的表达来实现。

3 调控细胞凋亡

细胞凋亡是放疗诱导CRC细胞死亡的主要机制[34-35]。当DNA发生损伤时，p53引起细胞周期停滞使细胞有足够的时间修复DNA损伤。如果细胞不能修复DNA损伤，p53将激活凋亡途径[36]。MDM2是p53的靶基因,同时MDM2癌蛋白也是p53功能的重要抑制剂，Xiao等[37]研究发现抑制视网膜母细胞瘤结合蛋白6(retinoblastoma binding protein 6,RBBP6)后，p53/MDM2相互作用减弱从而p53降解减少，引起细胞凋亡和周期停滞，因此，可以通过减少p53的降解，增加肿瘤细胞的凋亡，从而提高放疗对CRC细胞的治疗效果。

癌细胞中抗凋亡分子表达升高是肿瘤放射抗性和复发的重要标志，近年来，很多研究都表明抑制抗凋亡分子可以让放射治疗在肿瘤中取得更好的疗效。研究发现抗凋亡分子mRNA结合蛋白人抗原R(human antigen R,HuR)在多种肿瘤中表达，降低HuR的表达后caspase-2的促凋亡机制被激活，引起CRC细胞凋亡增加[38]。 一些最新的研究也发现有些药物通过增加放疗后的细胞凋亡来达到放疗增敏的作用，Survivin是一种凋亡抑制蛋白家族成员，可以帮助CRC细胞逃避放疗的伤害，与单独放疗相比，联合Selinexor(XPO1抑制剂)治疗可促进survivin的消耗，增加CRC细胞凋亡[39]；同时另一项研究发现应用基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1, SDF-1/CXCL12)的趋化因子受体CXCR4的抑制剂靶向CXCL12/CXCR4途径可减少survivin表达，激活caspase-3和caspase-9，从而增强了放疗后CRC细胞的凋亡[40]，提示我们将survivin作为靶点来增加CRC放疗的敏感性的可行性。人类磷脂酰乙醇胺结合蛋白4作为一种近些年被发现的抗凋亡因子，参与直肠癌的放疗抵抗，体外实验发现人类磷脂酰乙醇胺结合蛋白4抑制剂IOI- 42和放疗联合应用后明显抑制癌细胞集落形成[41],进一步证实抑制人类磷脂酰乙醇胺结合蛋白4可能增强直肠癌细胞的放射敏感性。

4 肿瘤微环境

对于CRC放疗增敏，我们不仅可以聚焦于癌细胞本身，同时也可着眼于肿瘤与其生长的基质之间复杂的相互作用，即肿瘤微环境。放疗可激活肿瘤微环境产生一系列的反应：炎症、缺氧、免疫调节、血运重建、癌症相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast，CAF)协调的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)重塑和纤维化；其中缺氧、免疫调节、CAF协调的ECM重塑和纤维化与肿瘤细胞的放射抗性密不可分[42]。

4.1 缺氧

缺氧是肿瘤生长中的关键调节因子[43]，其在细胞水平的应答主要通过缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factors，HIFs)介导[44]，现已证实HIF-1α的表达水平与肿瘤放疗后的凋亡、复发、远处转移等密切相关[45]。研究发现，能够适应缺氧微环境的肿瘤细胞具有产生放疗抗性的能力并且有对大多数放化疗方案不敏感的特点[46]。因此，我们可以通过药物途径下调HIF-1的表达从而控制CRC放疗抵抗。Gombodorj等[47]发现在CRC中，泛素结合酶E2抑制剂NSC697923通过抑制HIF-1α、HIF-2α和下游途径基因(包括APLN和CEMIP)来逆转放疗抵抗，动物实验也证实了NSC697923联合放疗对CRC有显著疗效，果糖二磷酸醛缩酶A(fructose-bisphosphate aldolase A，ALDOA)是HIFs下游的靶标和缺氧诱导型基因，Kawai等[48]证实了ALDOA在CRC细胞中高表达且在缺氧环境中表达进一步升高，后续实验发现ALDOA的下调显著诱导CRC衍生细胞系DLD-1和KM12SM细胞的放射敏感性，提示ALDOA可作为CRC治疗的潜在靶基因。

4.2 免疫调节

放射治疗导致局部损伤样炎症，诱导炎症反应，这种反应在本质上是抗肿瘤的，但同时具有免疫抑制作用。Liang等[49]发现在小鼠结肠癌模型中，肿瘤细胞依赖于STING/I型干扰素途径通过C-C趋化因子受体2(C-C motif chemokine receptor-2,CCR2)募集骨髓来源的抑制细胞(recruitment of myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)来增强免疫抑制作用产生外在放疗抗性，抗CCR2抗体治疗可以改善肿瘤细胞STING激活产生的放射抗性，肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)是存在于肿瘤组织中的特殊类型巨噬细胞，有研究者将CRC Lovo细胞与TAMs共培养后发现Lovo细胞的放疗抵抗和集落形成能力都得到了增强，进一步实验上调TAMs的自噬后，能够明显抑制CRC细胞的增殖，诱导其凋亡并且改变了CRC细胞放射敏感性相关蛋白的表达[50]，表明TAMs的自噬与CRC细胞的放疗敏感性有关。

4.3 CAF协调的ECM重塑和纤维化

肿瘤中的间充质细胞又称为癌症相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast,CAF)。CAF通过多种方式促进结肠肿瘤发展：调节肠道炎症、上皮细胞增殖、干细胞维持、血管生成、ECM重塑和转移[51]。在遗传上CAF通常比肿瘤细胞更稳定，所以相较于肿瘤细胞，将CAF作为治疗目标更有优势。Yang等[52]发现miR-31的表达在CRC相关CAFs中明显高于正常结直肠成纤维细胞(normal colorectal fibroblasts，NFs)，抑制与CAF共培养的CRC细胞miR-31的表达后，CAFs自噬和CRC细胞的放射敏感性明显得到提升。利用抗缺氧、抗ECM重塑和纤维化、免疫调节可逆转肿瘤放射抗性的特点，使用针对性的药物与放疗结合，可最大限度地发挥治疗效果，并最大限度地减少转移和复发的可能性。

5 总结与展望

我国CRC的发病率和死亡率逐年增高。放疗是其重要的治疗手段之一，但放疗同时不可避免地给患者带来急性或远期毒副反应，因此放疗敏感性的研究对于CRC患者综合治疗的方案制定至关重要。本文从DNA损伤修复、细胞周期、细胞凋亡和肿瘤微环境4个层面对CRC的放疗增敏进行综述，虽然目前放射增敏的研究和放疗增敏剂的应用取得了一定成果，但还有很多内容需要我们去探索。随着医学研究的持续深入，相信随着进一步探讨放疗增敏，结直肠肿瘤的放疗抵抗可以得到有效的改善。

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