骨关节炎关节软骨细胞凋亡的研究进展

王文涛，李斯明

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是最常见的退行 性关节疾病，中老年人好发。OA的主要病理变化包括关节软骨的进行性丢失和破坏、软骨下骨增厚、骨赘形成、滑膜炎症、韧带及半月板退行性变和关节帽肥大等[1-2]。而软骨细胞作为软骨组织中唯一的细胞类型，在软骨组织稳态的维持以及软骨细胞外基质代谢的调节中起重要作用。软骨受损时会分泌一系列新的蛋白来修复损伤的细胞外基质，这一过程将改变软骨的内环境平衡，增加相关细胞因子分泌，影响凋亡通路，导致软骨细胞凋亡，引起关节软骨退变甚至钙化，影响关节功能。本文围绕近年来OA 关节软骨细胞凋亡所涉及的炎症反应、信号通路及靶点调控等三方面内容，综述软骨细胞凋亡在OA发病机制中的重要作用，总结通过抑制软骨细胞凋亡而阻断关节软骨退变的机制，为OA的预防及早期治疗提供理论基础。

1 软骨细胞凋亡与炎症介质

既往普遍认为OA 是一种典型的非炎性关节病，后来人们发现OA 患者多伴有滑膜炎症，且炎症与OA 进展直接相关[3]，软骨细胞中的炎症介质，如活性氧（reactive oxygen species，ROS）、白细胞介素（interleukin，IL）、一氧化氮（nitric oxide，NO）和基质降解酶等，可通过某些途径（如死亡受体途径）诱导软骨细胞凋亡，进而引起关节软骨的退变[4]。

1.1 ROS

ROS 能够抑制成骨家族谱系细胞的增殖分化并导致其死亡，继而促进破骨细胞形成和分化，影响骨质疏松的发生发展[5-6]，从这个意义上讲，对于OA 等骨质疏松相关疾病，ROS 介导的氧化应激是关键的致病因素之一。

研究表明，OA 中软骨细胞凋亡可由ROS 及诱导型一氧化氮合酶（induced NO synthase，iNOS）表达的炎症介质引起；此外，ROS刺激下软骨蛋白水解酶合成水平更高，导致软骨细胞分解代谢过程中的平衡被打破[7]；而高水平ROS 聚集可破坏细胞膜、核酸、线粒体，并通过肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）桥接的ROS-TNF发生交联反应，进一步引起炎症和细胞死亡[8]。

抗氧化剂可削弱这一现象[5]，如过氧化氢酶，能够有效降低人类软骨细胞内ROS 含量，增强其对软骨细胞的抗凋亡作用，为软骨修复、体外活细胞扩增提供了新的研究方向[9]。

1.2 IL

IL-1 是人体炎症感染时产生的多功能细胞因子，而OA 软骨细胞凋亡受IL-1β水平的直接影响[10]。IL-1β可抑制细胞外基质蛋白合成，刺激细胞分解代谢蛋白酶的释放，进而干扰软骨细胞的代谢，介导对关节组织的破坏[11-12]；亦可通过损伤线粒体DNA、抑制转录等方式促进软骨细胞凋亡[13]；此外，IL-1β可通过提高TNF-α的活性来发挥协同效应[14]。诸多临床研究结果显示，OA患者血浆IL-4R、IL-6浓度显著高于健康对照组[15-16]，而这些细胞因子的水平与膝关节OA 的严重程度呈正相关[17-18]。

近年来OA 药物治疗的相关文献也从侧面证实IL 等促炎症因子与OA 的相关性。白藜芦醇被证实可通过抑制OA 大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-18 等促炎症细胞因子的表达，降低含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）3/9 活性，保护大鼠免受炎症损害，阻止关节炎进程[19-20]；Hu 等[21]研究发现芍药苷可调节bax/bcl-2/Caspase-3 信号通路，进而抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡。

1.3 NO

作为一种慢性关节炎症，OA 可导致NO 等炎症介质的过度产生[22]，反之，NO 可诱导线粒体损伤和Caspase-3 活化，Caspase-3 通过激活依赖Caspase 的核酸内切酶（Caspase activated dnase，CAD），引起细胞核内染色体DNA降解及凝结，同时促使细胞骨架蛋白的解体和重组，形成凋亡小体，进而诱导软骨细胞凋亡[23-24]。其另外一个作用途径是与超氧化阴离子反应生成过氧化亚硝基阴离子，在酸性条件下生成强氧化性和强细胞毒性的自由基，进而造成OA 软骨细胞和滑膜细胞的损伤[25]。

施犇等[26]探讨缓激肽B2 受体（bradykinin receptor B2，BDKRB2）+9/-9bp 基因多态性与OA患者血清NO的关系，结果显示+9/-9bp和-9/-9bp基因型OA 患者NO 水平明显高于正常人，血清NO 水平与BDKRB2 基因多态性、KL 分级呈正相关，提示BDKRB2+9/-9 bp多态性可能是OA的遗传调节剂，可通过影响人体血清中的NO 水平，间接影响OA的发病进程。

此外，诱导型iNOS 可通过调节NO 的生成来参与OA的发病进程，故其可作为治疗OA的潜在靶标[27]。药物、高压氧、低水平激光和低强度脉冲超声治疗均可通过直接抑制iNOS 的表达而发挥软骨保护功能，iNOS间接抑制剂（如IL-1抑制剂）也同样具有一定的软骨保护作用[28]。

1.4 基质降解酶

金属蛋白酶（metalloproteinase，MMP）家族有多个成员，其中以MMP-3、MMP-13 与OA 软骨细胞外基质降解最为密切，两者均可通过降解细胞外基质中的Ⅱ型胶原和蛋白聚糖，加剧软骨细胞凋亡，促使关节软骨的降解和破坏。检测关节液中MMP-2、MMP-3、MMP-9 和基质金属蛋白酶抑制 因 子（matrix metalloproteinase inhibitor，TIMP）-1 水平对OA 的早期诊断、病情判断、预后评价有一定的意义[29]。李保驰[30]研究发现，MMP-3、MMP-13蛋白在OA组滑膜中表达量明显高于非OA 组，且两者的表达水平呈正相关性，因此推测MMP-3、MMP-13 可能作为诊断OA 的一项重要指标。亦有学者指出，OA 患者病程越长、症状越重，滑膜中MMP-3、MMP-13和前炎症细胞因子IL-17 含量就越多，两者之间存在相关性；而在OA 的病理过程中，IL-17 能上调MMP-3、MMP-13的表达，致使MMP/TIMP比例失衡，进而引起关节软骨基质的退变[31]。

2 软骨细胞凋亡与信号通路

2.1 内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）反应通路

机体在接受某些理化因素刺激后，内质网中产生相当数量的折叠错误蛋白，出现未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR），相关信号通路得以激活，诱发ERS 反应途径并促进细胞凋亡。正常机体在应激状态下其内质网蛋白降解相关系统能调节折叠错误蛋白和未折叠蛋白，使其形成正确的折叠，继续维持软骨细胞活性；而当这种稳态失去平衡、ERS状态持续存在时，机体将激活细胞凋亡以清除这些受损的软骨细胞，引起关节软骨的进行性退化[32]。

有学者对正常患者及早期、晚期OA患者的软骨细胞进行检测，结果表明内质网功能标记物——B 细胞淋巴瘤/白血病（B-cell lymphoma/leukemia，Bcl）-2结合拮抗凋亡基因1（Bcl-2 associated athanogene 1，bag-1）和葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78，grp78）在晚期OA软骨细胞中的表达均上调[33]，提示ERS 系统充分参与了OA 软骨细胞凋亡的过程。ERS 还可与晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）构成分子复合体，在OA发病过程中发挥重要作用[34]。Takada 等[35]的研究亦表明，ERS 相关蛋白CHOP、Ub、pPERK 及pJNK 等与OA软骨细胞变性及凋亡均呈正相关，进一步证实了有关ERS 反应通路参与OA 软骨细胞凋亡、伴随OA进展的推测。

2.2 线粒体通路

OA 软骨细胞的线粒体常有一定程度的功能紊乱，加剧了软骨细胞的基质分化、凋亡及钙化，线粒体DNA的修整能力也同时下降，上述变化是促成OA 软骨细胞凋亡的关键因素之一[36]。在接受凋亡信号刺激后，软骨细胞内线粒体膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）开放，膜外电位变低，外膜破裂，细胞色素C（cytochrome C，cytC）、线粒体促凋亡蛋白Smac、凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor，AIF）等释放入细胞质，触发Caspase 级联反应，导致软骨细胞凋亡[37]。

已有实验证实，软骨细胞Ca2+持续增加可激活线粒体膜间隙钙蛋白酶，此酶可切断膜结合的AIF，可溶性的AIF 片段通过Bax/Bak 介导的小孔释放到线粒体外，或经MPTP 释放，最终导致软骨细胞凋亡[38]；Shen等[39]指出，线粒体途径相关的IL-1β在血清剥夺下具有显著的促凋亡作用。

有学者从威灵仙提取出富含皂苷的有效成分，结果表明，该成分能阻止线粒体膜电位去极化，抑制Caspase-3 活化，进而阻断软骨细胞的凋亡进程，保护软骨细胞[40]。

2.3 死亡受体通路

OA软骨细胞的病理变化归因于细胞凋亡[41]。而死亡受体是一组细胞表面标志物，与相对应的配体结合后可传递凋亡相关信号，进而参与OA软骨细胞的凋亡过程。

死亡受体通路最经典的是TNF和TNFR信号通路。TNFR 包括TNFR-1 和TNFR-2 两种受体。TNFR-1分布于体内大多数细胞（包括骨关节软骨细胞），内部有同源的氨基酸序列，即死亡结构域。当TNFR-1 的死亡结构域和TNF 受体相关死亡结构域（TNF receptor-associated death domain，TRADD）结合蛋白相结合时，就会启动OA软骨细胞的凋亡。 其与Fas 相关死亡结构域（Fas-associated death domain，FADD）蛋白结合，募集 与 活 化Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8，而FADD与Caspase-8前体形成死亡诱导信号复合物（death-inducing signaling complex，DISC），可催化Caspase-8 前体并激活Caspase-8；随后，Caspase-8又激活下游的Caspase-3 及其他效应Caspase，引起细胞凋亡[42]。近期高远[43]的研究还发现，TNFR信号通路能够在氧氟沙星和麻保沙星的诱导下被激活，增加相关下游信号因子的表达水平，促进幼龄犬软骨细胞的凋亡。

2.4 应激活化蛋白激酶信号通路

应激活化蛋白激酶又名c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK），正常情况下多存在于胞质内，受到刺激后快速堆积至核内，引起相关基因表达的变化。人丝裂原激活蛋白激酶1（human mitogen-activated protein kinase1，MAPK1）即可通过自身磷酸化，诱导激活JNK 信号通路，促进OA细胞凋亡[44]。

而作为与JNK 信号通路密切相关的生物分子，凋亡调节蛋白Bim亦与OA软骨细胞凋亡密切相关。Ye 等[45]采用IL-1β诱导鼠OA 软骨细胞，激活JNK-c-Jun 信号通路，c-Jun 蛋白与Bim 表达上升；通过RNA干扰技术干扰JNK-c-Jun通路后，再用IL-1β诱导鼠OA软骨细胞时Bim含量未见明显上调，证实JNK-c-Jun信号通路可直接上调Bim分子的表达水平，进而调控细胞凋亡。Ismail等[46]的研究还证实，JNK-2信号通路被IL-1β激活后，可诱导脂蛋白受体相关蛋白1（lipoprotein receptorrelated protein 1，LRP-1）从细胞膜上脱落，软骨细胞分泌的蛋白聚糖酶连续被LRP-1 内吞，导致软骨细胞基质分解增多，加速软骨细胞凋亡。而使用JNK 抑制剂CE11004 或SP600125 抑制JNK/c-Jun 通路后，凋亡调节因子p53 重组蛋白（P53 up-regulated modulator of apoptosis，PUMA）表达量明显减少，凋亡进程放缓，推测PUMA蛋白可能参与了JNK信号通路介导的软骨细胞凋亡过程[47]。总之，JNK 通路与OA 软骨细胞损伤、凋亡及诱导产生基质MMP 等密切相关，其异常激活可加速OA的进展。

3 软骨细胞凋亡与靶点调控

OA 软骨细胞凋亡受基因、蛋白质、微小RNA的影响，通过靶向调节这些细胞凋亡通路中的关键分子，可以实现对软骨细胞内环境平衡、线粒体膜通透性、内质网稳态等的调控，最终达到抑制软骨细胞凋亡的目的[48]。

3.1 基因靶点

3.1.1 SOX-9 作为一种高迁移率群结构域转录因子，SOX-9在软骨细胞和其他组织中均有表达，被认为是软骨细胞谱系调节器，能够增强软骨聚集蛋白多糖基因中启动子的活性，在软骨发生中起到关键作用[49]。Beckmann等[50]研究发现，OA软骨中SOX-9 表达增高后，软骨细胞存活数量相应增加，而SOX-9 表达减少则对人OA 软骨细胞凋亡产生重要影响。此外，在软骨间质前体中SOX-9是成骨细胞特异性基因强转录激活因子RUNX-2的主要调节因子，Orfanidou 等[51]研究发现，OA 患者软骨细胞中SOX-9 表达减少，RUNX-2 和MMP-13 表达增加，提示SOX-9 对软骨细胞有保护作用，RUNX-2和MMP-13对软骨有促降解和促凋亡作用。

3.1.2 Bcl-2 与BAX Bcl-2 定位于第18 号染色体，其家族基因可作用于线粒体，在凋亡中发挥相应功能。Li 等[52]的研究结果表明，Bcl-2 在膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）滑膜中高表达，其水平与KOA 严重程度呈正相关，检测KOA 患者Bcl-2水平有助于对KOA病情的正确判断。

Bcl-2家族含有一种特定的同源结构域，家族成员能借此构成同源二聚体，BAX 是其中的一员。当Bcl-2 超量组成Bcl-2 二聚体时，软骨细胞偏向于存活；而当BAX 超量构成BAX 二聚体时，软骨细胞则偏向于凋亡；Bcl-2与BAX之间也可构成二聚体，当Bcl-2/BAX比值升高时，抑制细胞凋亡，反之则促进凋亡[53]。马春辉等[54]认为，BAX表达上调是原发性OA发病的重要因素，而在继发性OA 中BAX 增加相对较少，这可能与软骨细胞中多种胶原及蛋白对表型的维持有关。

3.1.3 P53 相较于正常软骨细胞，OA 中P53 以及P53 调控相关的凋亡诱导蛋白（P53 apoptosis inducing protein，P53AIP）-1 表达水平上调更为明显，其与软骨细胞的凋亡直接关联[55]。Yan等[56]发现，通过miR-34模拟转染抑制沉默信息调节因子2 相 关 酶1（silent information regulator factor 2 related enzyme 1，siRT1）表达，可抑制P53 的脱乙酰化，导致BAX 表达量上升和Bcl-2 表达水平降低，从而促进凋亡；而关节内注射抗miR-34 序列慢病毒载体可有效改善OA的进展，这为OA的治疗选择提供了一个新的方向。

3.2 蛋白质靶点

3.2.1 Caspase蛋白质 目前发现的Caspase家族至少有14种，与真核细胞的凋亡密切相关，其所引发的级联反应是细胞凋亡过程的关键环节，可激活包括死亡受体和线粒体依赖途径介导的信号转导途径，被激活后的下游Caspase通过切割特异性底物导致细胞凋亡。其中Caspase-3与OA软骨细胞凋亡的联系最为紧密[57]。陈喜德等[58]探讨OA 大鼠关节软骨细胞凋亡与Caspase-3表达的关系，结果显示，随着OA程度的加重，Caspase-3表达水平逐渐增加，且Caspase-3 mRNA的相对表达量与软骨细胞凋亡的程度基本一致。

研发者们目前开始关注Caspase 抑制剂（OA药物）的开发[59]。现有研究亦表明，针刀、圆利针和电针等物理治疗可借由下调BAX、Caspase-3表达来抑制兔股直肌细胞凋亡，对OA产生积极的治疗效果；而不同类型的物理治疗，如针灸治疗、电疗、运动疗法，其作用机制可能存在一定差异[60]。

3.2.2 Fas/FasL Fas 及其配体FasL 是细胞凋亡的膜表面分子，作为死亡受体家族成员，Fas/FasL 与其他死亡受体可直接关联并影响OA 软骨细胞的凋亡[61]。

临床和药理学方面，OA 患者血清中FasL 蛋白表达含量越高，则病情越轻，这也从一个侧面提示FasL在抑制软骨细胞凋亡过程中可能扮演重要角色[62]。武中庆等[63]发现中药“右归饮”可通过上调Fas、FasL 的表达水平，达到抑制膝软骨细胞凋亡的目的；涂意辉等[61]证实地塞米松可诱导Fas/FasL 的凋亡，进而上调凋亡基因表达。以上研究均为OA软骨细胞凋亡的深入研究提供了思路。

3.3 miRNA靶点

3.3.1 miRNA-9 miRNA 是一种长度为21～25 个核苷酸的小分子RNA。研究发现，OA 患者软骨组织中miRNA-9 表达水平明显下降，MMP-13 表达水平明显上升，二者之间存在互补结合位点，MMP-13 作为miRNA-9 的靶基因，受到其靶向调控，也就是说，miRNA-9可能通过抑制MMP-13的表达水平、降低其对Ⅱ型胶原蛋白的抑制作用来对抗OA[64]。而在关节腔内注射miRNA-9 激动剂后，OA大鼠软骨组织中MMP-13表达水平受到抑制，其对Ⅱ型胶原α1链的拮抗作用减弱，胶原降解减少，OA的发展进程受阻[65]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和转录因子RUNX-2 等OA 相关基因的表达也受miRNA-9 表达水平的调控，其调控机制有待进一步的深入研究[64]。总之，人们可通过对miRNA-9的靶向激活调控，下调MMP-13 等的表达水平，减少OA 软骨外基质的降解，延缓OA 的疾病发展进程。

3.3.2 miRNA-25 miRNA-25 属于miR-106b-25簇，定位于7 号染色体的微染色体维持蛋白7（microchromosome maintenance protein，MCM7）基因的内含子上。miRNA-25 在OA 中起到抑制软骨细胞凋亡的作用，其过度表达可阻止OA软骨细胞凋亡并促进其增殖，抑制蛋白多糖、胶原蛋白降解，这可能为OA治疗提供了新的策略[66]。

3.3.3 miRNA-30 研究证实miRNA-30可抑制基质降解酶ADAMTS-5的表达，OA患者中miRNA-30表达水平下调而ADAMTS-5 表达上调，促进软骨细胞外基质降解，加速OA 患者软骨细胞凋亡[67]。此外，也有实验证实IL-1/AP-1/miRNA-30a/ADAMTS-5 通路参与了IL-1β诱导的人OA 软骨细胞软骨基质的降解过程[68]。总之，miRNA-30与ADAMTS-5 可作为软骨稳态的关键调节因子，是OA的潜在诊断和治疗靶点。

3.3.4 miRNA-34a 人们发现在OA 软骨组织中，miRNA-34a的表达与IL-1β表达上调呈正相关，而在IL-1β诱导的软骨细胞凋亡模型中，过表达的miRNA-34a会导致Sirt1及Bcl-2表达降低，从而促进软骨细胞凋亡[69]，因此沉默miRNA-34a 可能成为治疗OA的新方法。

4 总结与展望

在OA 的发生发展进程中，ROS、IL、NO、MMP等炎症介质与软骨细胞凋亡关系密切；与此同时，软骨细胞凋亡存在ERS 反应通路、线粒体通路、死亡受体通路、JNK 信号通路等，这些信号通路与软骨细胞的凋亡过程直接相关，对这一过程中的基因靶点、蛋白质靶点或miRNA靶点进行调控，将有助于延缓OA 进程。目前有关各个信号通路的分子调节机制及各因子的相互联系尚未完全阐明，未来可基于以上研究研发具有针对性的靶点药物，为OA 的早期预防及治疗提供新思路。