3D打印多孔材料应用于骨缺损修复的研究进展*

王进 葛建飞** 郭开今 郑欣

（1.苏州大学附属张家港医院骨科，江苏苏州 215600；2.徐州医科大学附属医院骨科，江苏徐州 221002）

3D 打印技术是一项新型数字化快速成型技术，也称为增材制造技术，它是在计算机辅助下，以物体的计算机辅助设计（computer aided design,CAD）模型或CT扫描等数据为基础，利用金属粉末、陶瓷等原材料，通过“分层制造、逐层叠加”的方式快速构造任意复杂结构的物理模型[1,2]。骨科较常用的3D打印技术主要包括光固化立体打印、选择性激光烧结、熔融沉积成型、金属直接熔融、喷墨打印等[3]。

由高能量创伤、骨肿瘤切除、骨髓炎清创等原因造成的大段骨缺损，如何修复一直是临床医师面临的巨大难题。传统治疗技术存在诸多弊端：自体骨移植被视为修复骨缺损的“金标准”，但其取材有限，需进行额外手术取骨而造成取骨区出血、疼痛、感染等并发症；同种异体骨移植存在传播疾病、诱发免疫反应、骨愈合不良等缺陷[4,5]。近年来，随着材料学、工程学、生命科学的快速发展，骨组织工程支架材料用于骨缺损修复的研究受到广泛关注。传统制备工艺加工的多孔支架材料内部孔隙结构不可控、外形与宿主骨缺损不完全匹配，很难满足实际需求[6]。利用3D打印技术制备的多孔支架材料不仅可以构建与缺损骨组织相匹配的复杂外形，还可以精确调控内部孔隙结构，同时可携带生物活性因子及细胞进行骨缺损部位的原位打印，从而获得理想的骨修复效果[3,7,8]。本文就3D 打印技术制备的不同骨缺损修复多孔支架材料的研究进展作一综述。

1 常见的3D打印多孔材料

1.1 金属材料

金属因其良好的生物相容性、较强的耐疲劳性及优异的力学性能而被广泛应用于骨组织工程，目前常见的金属支架材料包括钛及其合金、钴、镍合金、不锈钢等。金属熔融温度较高，支架材料3D打印需要特定的高温条件，无法同步涂层生物活性因子或细胞混合打印[9]。钛及其合金是目前应用最广泛的金属支架材料，Nune等[10]采用3D打印技术制备3种不同孔径及孔隙率的多孔钛（porous titanium,pTi）支架，平均孔径分别为700、1000、1500 μm，孔隙率分别为76.1%、85.6%、90.3%，通过与前成骨细胞共培养检测其生物学功能，结果显示pTi支架均有利于前成骨细胞黏附、增殖、矿化及分化，不同孔径钛支架之间细胞活性差异无统计学意义。邓威等[11]将3D 打印pTi 材料植入兔股骨髁缺损，术后第12周Micro-CT扫描及硬组织切片染色结果均显示材料周围及孔隙内长入大量新生骨组织，表明3D打印pTi材料具有优异的骨修复性能。钽、铌金属因其高容积孔隙率、低弹性模量及高表面摩擦性能，成为金属材料研究的热点。但是钽、铌材料价格昂贵，且具有强氧化性和高熔融温度，使得3D打印纯钽、铌多孔支架的研究受到极大限制，目前多将钽、铌金属制作成涂层用于传统金属材料（如钛合金、不锈钢等）表面改性处理，以节约成本，并增强支架骨修复性能[12,13]。钛、钽、铌等金属因不具有生物可降解性，致使其研究受限，而镁金属作为一种新型可降解金属材料，是今后的研究热点，其植入体内后可降解成无毒物质排出体外，且降解过程中释放镁离子，可促进成骨反应。然而纯镁生理环境中降解太快，骨组织愈合之前就失去力学性能，且降解过程中会产生过多氢气，超过宿主组织的处理能力，所以当前镁金属的研究侧重于制备镁合金材料或构建其他保护涂层以增强镁金属的抗腐蚀性能[14,15]。Yu等[16]采用激光打孔法制备多孔镁合金支架，并构建氟化镁涂层以提高支架的抗腐蚀性能，通过与骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）共培养以探讨支架的细胞相容性，结果表明氟化镁涂层多孔镁合金支架具有良好的生物相容性，并能促进BMSCs的增殖活性。

1.2 生物陶瓷材料

生物陶瓷类似于天然骨的无机成分，可提供优良的骨传导性能，并具有良好的生物相容性、生物降解性及较强的抗压性能，部分抗压强度可达到松质骨生物力学要求。常用的生物陶瓷材料主要包括羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）、β-磷酸三钙（β-trical⁃cium phosphate,β-TCP）、双相磷酸钙、磷酸镁（magne⁃sium phosphate,MP）、氧化铝、氧化锆等。但生物陶瓷脆性大、韧性差、剪切应力低，且降解不全，同样需要特定的高温条件进行3D 打印，不能同步涂层生物活性因子或抗感染药物[9]。Warnke 等[17]运用3D 打印技术分别制备HA 及磷酸三钙（tricalcium phosphate,TCP）多孔支架，并以商品化的骨替代材料Bio-Oss®作为对照，进行材料的表征及生物相容性研究，细胞活力染色、MTT、LDH、WST 结果均显示HA 多孔支架的生物相容性优于Bio-Oss®材料，而Bio-Oss®材料的生物相容性又优于TCP 多孔支架。在材料表面制备类似于骨小梁的微孔结构，可以为骨组织的长入提供条件，Kim等[18]采用3D打印结合自固化反应及盐析法制备表面具有微孔结构的MP多孔支架，与表面无微孔结构的MP多孔支架相比，其孔隙率、降解性能、骨生成及骨塑形能力大大增加。掺杂功能性元素的生物陶瓷3D 打印研究同样受到广泛关注，Deng 等[19]将含锰元素的β-TCP 通过3D 打印技术制备成有序大孔结构的支架，锰元素的引入显著提高支架的抗压强度及致密度，且随着支架的降解缓慢释放锰离子，刺激软骨生长，加速软骨下骨的修复。Tarafder等[20]应用3D打印技术制备含锶及镁元素的TCP多孔支架，通过大鼠体内实验验证同样具有优异的骨修复性能。然而，传统3D 打印工艺制备的多孔支架多由实心基元堆叠而成，降低了材料的孔隙率；且多孔支架的孔隙呈阶梯三维延伸状，不是平直的管道状，在流体力学方面存在较强的流体阻力，不利于营养物质的扩散及细胞的长入。Feng 等[21]受到自然界中莲藕内部平行多通道结构的启发，采用3D 打印制备出空心管基元堆叠而成的仿生莲藕支架，与传统3D打印多孔支架相比，拥有更高的孔隙率，更有利于骨细胞黏附、增殖及骨组织再生，且该方法可用于多种生物陶瓷（镁黄长石、氧化铝、氧化锆）、金属材料等制备仿生莲藕支架，拥有广阔的应用前景。

1.3 聚合材料

聚合材料可分为人工合成聚合材料和天然聚合材料。人工合成聚合材料主要有聚乳酸[poly（lactic acid）,PLA]、聚乙醇酸、聚己内酯（polycaprolactone,PCL）、聚乙二醇、聚乳酸羟基乙酸共聚物[poly（lac⁃tic-co-glycolic acid）,PLGA]等，这类材料来源广泛，具有良好的生物相容性及生物降解性，且可按需定制，优化其化学和生物力学性能。然而人工合成聚合材料多难溶于水，常需氯仿等有机溶剂作为黏结剂，但氯仿难以完全去除易导致毒性反应；人工合成聚合材料降解产生酸性产物，易引起炎症反应；局部环境低pH 可加速材料降解，影响支架的机械强度[9]。单一3D 打印人工合成聚合材料各有优缺点，Danilevicius 等[22]采用3D 打印技术制备4 种不同孔隙率及孔径的多孔PLA支架，孔隙率分别为70%、82%、86%及90%，孔径分别为25 μm、50 μm、70 μm及110 μm，研究多孔支架孔隙率对前成骨细胞生物学特性的影响，结果显示孔隙率为70%的多孔支架未见细胞长入，孔隙率为86%的多孔支架最有利于细胞黏附生长。Park等[23]运用3D打印技术分别制备多孔PCL支架、多孔PLGA 支架，体外实验表明两种支架材料均具有良好的生物相容性，通过12 周兔体内实验表明两种支架材料均可不同程度的促进骨再生，但PLGA支架降解过快，不能提供足够的力学支撑，从而导致PLGA支架的骨修复性能弱于PCL支架。两种人工合成聚合材料制备复合支架的研究也备受关注，Kim和Cho[24]以PCL、PLGA为原材料，应用新型多头沉积技术制备PCL/PLGA多孔支架，该支架具有600 μm的均一孔径和69.6%的孔隙率，在细胞实验中表现出良好的生物相容性。局部氧化可提高人工合成聚合材料的性能，有研究表明随着氧化程度的增加，聚乙烯醇多孔支架的降解程度及蛋白释放特性均显著增强[25]。天然聚合材料常见的有胶原、壳聚糖（chitosan,CS）、丝素蛋白、海藻酸盐、透明质酸、脱钙骨基质等，这类材料具有良好的生物相容性、生物降解性，并具有天然多孔结构及优异的亲水性能，有利于细胞黏附、增殖及分化。天然聚合材料均可用于骨修复多孔支架的3D打印，但他们难以大量获取，且降解速率过快并缺乏一定的生物力学强度，较少单独用作组织工程支架材料，常作为生物活性材料应用于复合多孔支架的制备[2,26]。

1.4 复合材料

复合材料由两种或更多种不同的材料如金属与生物陶瓷、聚合材料与生物陶瓷等构建而成，可综合各种材料的优点，取长补短，以更大程度满足组织工程多孔支架的需求。3D打印技术制备的金属多孔支架表面构建生物陶瓷或聚合材料涂层，即将金属多孔支架的优异力学性能与生物陶瓷、聚合材料的优异生物学性能有机结合，是金属多孔支架复合材料研究的热点。Ma等[26]应用冷冻干燥技术在3D打印制备的pTi支架表面成功构建CS/HA涂层，该复合支架的生物力学性能与自然骨相匹配，较未涂层pTi支架更适合成骨细胞的黏附、增殖，是一种理想的负重部位骨修复材料。Li等[7]借助仿生技术成功制备HA/聚多巴胺涂层3D打印pTi支架，与未涂层pTi支架相比，细胞黏附增殖及成骨活性显著增强；通过将复合涂层pTi支架植入兔股骨髁骨缺损模型中，发现HA/聚多巴胺涂层改性处理可以显著提高pTi支架的骨修复及骨整合能力。

聚合材料与生物陶瓷的结合，如同骨组织中有机成分与无机成分的结合，更接近真实的骨基质环境，被广泛用于骨组织工程研究。低温3D打印技术可以保留聚合材料与生物陶瓷材料的自然属性，是近年来3D打印研究的新突破。Lin等[2]利用低温3D打印技术构建基于胶原/HA的仿生多孔支架，该支架具有三维交联的多孔结构并基本保留了原材料本身的特性，与非打印支架相比，可以显著提高细胞黏附及促成骨作用。Jakus等[27]将90%HA与10%PCL（或10%PLGA）混合，作为3D打印墨水，室温下制备成超弹性多孔支架，这种支架表现出良好的弹性及韧性，在受到挤压时可迅速复原，且支持细胞生长、增殖，并可诱导成骨分化；通过将支架植入大鼠脊柱融合模型及猴颅骨缺损模型中发现，该超弹性多孔支架可与周围组织快速整合，并可促进血管生成及骨再生。金属功能性元素也可掺杂于复合材料中，Li等[28]应用低温3D打印技术将具有促成骨活性的金属镁均匀复合入PLGA/TCP可降解多孔支架中，该复合支架具有极高的孔隙连通性和理想的仿生多孔结构，在体外研究中，表现出优异的骨传导及骨诱导活性，可促进骨组织的生长。

在复合支架的研究中还可以根据需要添加生物活性分子，使得支架具有更强的骨再生能力。淫羊藿苷是一种具有促成骨活性的天然植物小分子，Lai等[29]将淫羊藿苷与PLGA/TCP 材料均匀混合，应用低温3D 打印技术制备成多孔复合支架，该多孔支架具有优异的骨传导特性能力，复合的淫羊藿苷可以在植入部位稳定释放活性成分，原位促进植入部位的新骨再生。软骨源性形态发生蛋白1 因其特有的促软骨形成的作用而受到广泛关注，徐燕等[30]利用3D 打印技术制备PCL/HA支架，借助多巴胺表面修饰，将软骨源性形态发生蛋白1负载于支架上，体外与人BMSCs共培养，可明显促进细胞黏附、增殖及成软骨分化。

2 3D细胞或组织打印

3D 打印的细胞或组织打印技术是将细胞、生长因子与支架材料同时打印，制备出带有生命的“活”的支架。其优势在于：①相比于在已成型的支架中接种细胞，其可以获得更高的细胞密度；②可精确调控细胞的空间分布，进而调节细胞间、细胞与支架材料间的相互作用，促进细胞最终形成功能活性组织[9]。目前，3D细胞和组织打印主要是基于携带细胞的水凝胶3D 沉积技术，尤其在软骨组织工程支架的构建中应用最为广泛。聚合材料是最常见的打印墨水，Markstedt 等[31]将纳米纤维素、藻酸盐混合作为打印墨水与人软骨细胞一起进行3D 打印，以软骨组织的CT扫描数据为模板，打印出半月板及人耳，经过7 d的培养后，该复合物仍表现出86%的细胞活性。Kun⁃du 等[32]将PCL 和封装软骨细胞的藻酸盐通过多头沉积技术进行3D 打印构建软骨组织支架，通过裸鼠皮下种植可见软骨细胞分化良好。生物陶瓷材料也可用于3D 细胞或组织打印，Gao 等[33]将人BMSCs 与生物活性玻璃（bioactive glass,BG）及HA纳米粒混合共同打印，经过21 d的培养，细胞活性及复合物的弹性模量均明显增强。然而，大多数生物打印墨水难以模拟天然细胞外基质的复杂环境，无法完美重建细胞的形态及功能。Pati等[34]以脱细胞的细胞外基质作为打印墨水，装载细胞后打印，能为细胞生长提供一个优异的微环境，且这种方法具有多样性及灵活性，可用于软骨、脂肪及心脏组织的打印。

3 3D打印载药材料

载药的3D打印多孔支架通常是在传统多孔支架的基础上，以其为基底，再经过不同技术处理以载入相应抗菌、抗结核等药物。Han等[35]运用电沉积技术在3D打印制备的多孔钴铬支架表面构建丝素蛋白-庆大霉素复合涂层，结果显示金属支架的力学强度没有受到电化学腐蚀的影响，同时涂层改善了支架材料的生物活性并具有良好的抗菌性能。银及纳米粒子因具有良好的抗菌活性而受到广泛关注，Zhang等[36]首先制备3D打印β-TCP多孔支架，然后应用浸渍法构建载银纳米氧化石墨烯复合涂层，通过革兰阴性菌的抑菌实验评估，该复合支架表现出优异的抗菌活性，通过与兔骨髓基质细胞共培养，发现其可显著提高碱性磷酸酶活性及成骨相关基因的表达。骨关节结核治疗中，为避免长期抗结核药物治疗带来的耐药性及全身毒副作用，有研究通过前期化学改性处理的BG和二氧化硅纳米粒为基材负载异烟肼和利福平，运用3D打印技术制备分层多孔复合支架，体内外实验表明，与商品磷酸钙载药支架相比，该复合支架具有优异的抗结核药物缓释特性，且可维持体内有效杀菌浓度达12周之久[37]。除了可以有效抗结核治疗外，该复合支架还具有良好的骨缺损修复性能。这种结合优异抗菌、抗结核活性与良好成骨性能于一体的双功能多孔复合支架在感染性骨缺损的修复重建及骨关节结核的治疗中拥有广阔的应用前景。

4 总结与展望

虽然3D打印多孔材料具有个性化及多样化的优势，但其研发仍然存在一些不可回避的问题：①目前对于可以维持细胞活性及其功能的生物活性材料的研究还处于实验阶段；②3D打印多孔组织工程支架的最适参数尚无定论[3,38]，如支架的最适孔径、孔隙率、降解速率等。目前3D打印机的分辨率较低，远达不到骨组织纳米级的超微结构水平，故还需提高打印设备的分辨率来增强支架的性能；③人体骨组织是由蛋白质、钙等多种物质组成，其力学性能适应人体需求，而传统3D打印多孔支架通常局限于单一材料，支架性能与骨修复需求不吻合，综合多种材料的优点来构建骨组织工程复合支架的研究还较少；④在细胞或组织打印方面，目前只能运用单一活性细胞进行打印，无法同时构建神经、血管网等精细结构，不能重现人体组织、器官功能的复杂多样性；⑤载药3D打印多孔支架的研究还处于初级起步阶段，对于药物释放特性及支架的成骨性能、降解性能还不能完全匹配。

目前，4D打印的理念[39,40]已被提出，即在3D打印三维的基础上加入了时间的维度，使打印的物体可以随时间发生动态改变，不再是静止、无生命的，增加了打印物体结构和功能的可设计性，但仍需更深入的研究，以满足不同患者的临床需求。