环境暴露在过敏性疾病中的重要作用

林新鎏，郑振宇，任 霞，杨朝崴，苏 钟，李 靖

1 过敏性疾病患病率流行趋势

1.1 过敏性疾病全国流行趋势

在过去30年里，哮喘等过敏性疾病的发病率在世界范围内呈上升趋势[1]。中国哮喘和过敏的患病率也逐年增长，广州呼吸健康研究院于1994年至2010年采用ISAAC问卷调查方案，发现广州市儿童哮喘和过敏性鼻炎患病率从1994年的3.9%和17.4%上升到2001年的4.6%和22.4%，再上升至2009年的6.9%和25.1%[2]。1990年、2000年、2010年开展的全国内陆城市儿童哮喘流行病学研究也显示，一些大城市的哮喘患病率持续上升，例如北京地区儿童的患病率分别为0.77%、2.05%和2.55%，上海地区的患病率分别为1.50%、3.34%和5.73%[3-5]。

1.2 过敏性疾病城乡发病率差异

与经济发达地区过敏性疾病患病率显著升高不同，在部分缺乏城市化进程的环境下人群患病率较低。已报道的两种典型的保护性环境包括，欧洲农场环境和农村环境，这两种环境下人群患病率保持较低的患病率[6-7]。Stein等[8]比较各30 例匹配的分别来自传统农场环境的Amish儿童和现代化农场环境的Hutterite 儿童，虽然两者有着相似的遗传背景和生活方式，但Hutterite人群的哮喘和过敏性疾病患病率分别是Amish人群的4倍和6倍，而Amish家居灰尘中的内毒素水平却是后者的6.8倍。课题组对广州市区和从化农村的13～14岁儿童过敏性疾病进行对比研究，结果发现农村儿童的哮喘患病率显著低于城市儿童(3.4%vs. 6.9%)，过敏性鼻炎和湿疹患病率也发现相似的城乡差异[9]。与中国南方地区类似，北京周边农村地区儿童哮喘患病率亦显著低于北京市区儿童(1.1%vs. 6.3%)[6]。

西方发达国家的食物过敏患病率持续升高，但地区间差异显著。最近一项荟萃分析显示，欧洲17岁以下儿童自我报告的食物过敏患病率为6.9%；当结合sIgE阳性结果时，患病率降至3.6%[10]。亚洲地区儿童和西方国家的食物过敏患病率差异很大。在泰国北部地区，家长自我报告的食物过敏患病率为9.3%，通过食物激发试验明确的患病率为1.1%[11]。课题组采用欧洲Europrevall-INCO标准化问卷，对广州城市和韶关农村5～15岁学龄儿童进行横断面调查研究，结果两地自我报告的食物过敏(3.7%)和IgE介导的食物过敏(0.3%)的患病率均很低，且城乡之间没有显著性差异(0.36%vs. 0.30%，P=0.586)。而最近Botha等[12]首次对由食物激发试验诊断的食物过敏进行城乡比较，显示南非农村人口的食物过敏患病率和致敏率都比较低。这提示食物过敏在亚洲的模式特征可能有别于西方国家，还需要进一步探讨。

2 过敏原致敏情况

2.1 吸入性过敏原

尘螨是中国南方地区最常见的吸入性过敏原。其他常见的吸入过敏原包括蟑螂、猫毛和狗毛等。国内研究显示，分别有59.0%、57.6%和40.7%的过敏患者对粉尘螨(Der-f)、屋尘螨(Der-p)以及热带螨过敏[13]。课题组的数据显示，Der-f、Der-p致敏儿童的喘息患病率分别从2001年的14.4%、15.3%上升到2009年的30.9%、33.1%。同时，对尘螨致敏儿童的喘息患病率显著高于非致敏儿童[2]。2002年广州儿童对Der-p、Der-f、猫毛和混合草花粉等过敏原的致敏率分别为41.7%、42.7%、4.7%和0.5%，到2010年显著增加(分别为55.0%、55.0%、17.1%和3.7%)。与此相反，蟑螂致敏率从2002年的16.0%下降到2010年的7.6%[2]。笔者一项针对中国鼻炎伴或不伴哮喘患者的多中心研究显示，美洲大蠊和德国小蠊的致敏率分别为26.34%和19.37%，尽管致敏患者对蟑螂暴露的皮肤反应较轻，但蟑螂的致敏性与哮喘的患病率之间存在显著相关性[14]。后续研究发现，韶关农村地区蟑螂过敏原致敏率显著高于广州城市[15]。我国北方地区，Wang等[16]调查内蒙古地区过敏性鼻炎患病率为32.4%，其中半数以上为花粉症相关过敏性鼻炎，其患病率高达18.5%。

2.2 食物过敏原

大量的研究数据显示，食物过敏非常常见，其患病率呈上升趋势，且存在地域差异。国内重庆地区有一单中心横断面儿童食物过敏的报道，从1999年到2009年，食物过敏患病率从3.5%上升到了7.7%[17]。本课题组在城乡食物过敏研究的后续病例对照研究中发现，韶关农村儿童皮肤点刺试验(30.2%vs. 9.7%)与血清sIgE(48.8%vs. 31.0%)检出的食物过敏原阳性率(致敏率)均显著高于广州市区。进食虾、蟹是导致广州和韶关地区学龄儿童食物过敏的主要原因。但农村儿童的食物过敏患病率很低，两者之间存在分离，其原因仍需要进一步的研究验证。

3 危险因素及微生物暴露

3.1 过敏性疾病危险因素

哮喘发病机制为多因素性，其发病危险因素中最重要的是遗传和环境因素，由于遗传背景不可能在短短数十年内发生显著变化，所以环境因素可能是该病的决定因素。1989年，Strachan[18]首次提出卫生假说，认为人类过敏性疾病和自身免疫疾病的迅速上升要归因于太过干净的环境，但环境中起重要作用的暴露因子尚不清楚。在随后近30年间，国际多个团队对儿童哮喘患病率与环境暴露因素进行相关分析并探讨可能的分子机制[19]。Braun-Fahrlander等[20]在1999年首次发现农场长大的儿童发展为过敏体质及过敏性疾病的概率显著低于非农场儿童。随后多项系列研究,包括欧洲农场环境[21-23]、美国Amish传统农场及Hutterite现代农场环境[8]及城市和农村的对比研究[9,24-26]，均验证了农场环境的保护作用，称为“农场效应”[27]。三种环境的共性表现是，生命早期暴露于农场环境(尤其是传统农场)或农村环境的人群，过敏性疾病的患病率显著低于缺乏相关保护性暴露因子的人群。由于环境的多样性，不同研究发现的保护性环境因子并不完全相同，可能的因子包括接触农场牲畜、农作物[21]、未消毒牛奶[28-30]、母乳喂养[26]、农场或农村耕种活动[9,31]等。

在ISAAC国际多中心研究框架下，通过使用标准化的流行病学调查问卷，本课题组系列研究[9]及首都儿科研究所[6]等相关研究均确认了中国南方和北方农村环境的保护作用。本课题组对广东省的广州市区和从化农村的调查研究，显示农村的种植环境和家居粉尘的内毒素水平成为从化儿童哮喘发病的保护因素[9]。而Kim等[32]则发现，中国部分农村人群存在低过敏性疾病患病率但高过敏体质的分离现象，其原因尚不清楚，部分原因可能在于过敏原的交叉反应性，例如中国南方农村虾致敏儿童可能是由蟑螂过敏造成[33]。

3.2 微生物组分、种类及多样性

内毒素及微生物暴露可能是不同环境暴露作用的共有关键因子之一。农场及农村环境存在高水平内毒素暴露，其与低过敏性疾病患病率相关[34-36]。2015年，发表在Science杂志的研究发现，内毒素的保护作用可能与诱导肺上皮细胞中A20表达上调有关[37]。2016年，NEnglJMed杂志发表的一项研究发现，Amish传统农场内毒素含量是Hutterite现代农场的6.8倍，可调节儿童固有免疫通路进而预防过敏性疾病的发生。除内毒素的调节作用外，多种微生物相关模式识别分子(PAMP)，包括胞外多糖(extracellular polysaccharides，EPS)、胞壁酸(muramic acid)、β-葡聚糖(glucans)等与农场保护效应密切相关[38]。此外，Debarry 等[39]从农场环境中筛选出两种细菌(Acinetobacter lwoffii与Lactococcus lactis)可诱导Th1细胞分化，介导过敏保护作用。Ege 等[40]首次报道屋尘中细菌和真菌多样性与暴露儿童哮喘发病率显著负相关，为环境保护效应提出新假说。

4 环境因素与过敏性疾病免疫学调控

过敏性疾病患病率的急剧增加与环境变化之间的关系尚认识不足，但通常认为和卫生假说有关[18]。近年来已逐渐明确过敏性疾病作为一种异质性疾病，具有不同致病机制，固有免疫及获得性免疫均参与其中。诱发因素包括过敏原暴露、微生物感染、氧化应激诱导，涉及的细胞包括嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、Th2细胞、树突状细胞(DC)、中性粒细胞、NKT细胞、自然辅助细胞、上皮细胞、Th17细胞和巨噬细胞等[41]。

4.1 固有免疫机制

人类进化过程中，伴随着与周围病原体相互作用或共生，如某些肠道和呼吸道菌群与寄生虫等广泛存在病原相关分子模式(PAMP)，可通过结合宿主DC等固有免疫细胞表达的多种模式识别受体(PRR)，如Toll样受体(TLR)，从而产生免疫应答。研究发现，农场暴露儿童与非暴露儿童相比，其CD14/TLR2表达水平升高，表明生命早期农场环境暴露通过TLR受体等通路对过敏性疾病起重要调控作用[42]。随后的研究表明，母亲产前暴露在富含微生物环境中能使后代TLR2/TLR4/CD14固有免疫系统受体上调，其机制可能与宫内环境或表观遗传改变有关，有待进一步阐明[43]。TLRs被认为是免疫应答调节的关键系统，上皮细胞和DC在连接先天免疫系统和适应性免疫系统中起着关键作用。早期暴露于内毒素(LPS)会减弱产生过敏性细胞因子所需信号通路，但会保留dsRNA/DCs通路，从而激活DCs产生更多Th1细胞因子。此外，LPS暴露增加锌脂蛋白A20合成[44]，从而抑制气道上皮对屋尘螨的过敏反应[45]。一项前瞻性研究表明，母亲产前接触农场动物，其后代脐带血TLR5、TLR9明显升高，且特应性皮炎患病风险明显下降[46]。如前述及Stein等[8]比较各30 例Amish 儿童和Hutterite 儿童外周血白细胞的组成和表型，结果Amish儿童嗜酸性粒细胞比例降低，单核细胞表现出抑制表型(HLA-DR低水平、ILT3高水平)。且Amish灰尘提取物对哮喘动物模型有明显保护作用，在缺乏MyD88的小鼠中，此保护作用急剧下降，而在缺乏MyD88和TRIF的小鼠，此保护作用被完全废除，而这两种分子位于多条固有免疫信号通路的汇聚点，因此，提示农场环境通过固有免疫发挥对过敏性疾病的保护作用。

目前已知，环境中除内毒素外，尚有大量其他类型微生物产物，它们共同组成固有免疫系统的有效刺激物[47-48]。iNKT细胞能识别糖脂类抗原，部分PAMP可不经TLR直接激活iNKT细胞。屋尘提取物(HDE)能通过iNKT细胞，促进OVA诱导哮喘小鼠气道炎症，但尚未找到HDE中iNKT相关抗原来源[49]。然而，有研究发现乳鼠感染甲流可以保护成年鼠免受过敏原诱导AHR，这与肺内DN CD38亚群在NKT细胞优势扩展有关，并首次提出富集的DN、T-bet-依赖性、分泌γ-干扰素的NKT细胞亚群能强有力地抑制AHR的发展[50]。2019年，有学者提出早期/新生儿期感染或抗原刺激可通过肺部NKT细胞的某些亚群如CD38hiDN NKT细胞，产生IFN-γ，而非IL-17、IL-4或IL-13，并且首次证明这些亚群能直接接触抑制CD4+T细胞增殖，从而阻止过敏原诱导的AHR[51]。总之NKT细胞不同亚群在过敏性疾病中通过不同机制，执行不同功能，值得进一步深入研究。

4.2 获得性免疫机制

2000年，Gereda等[52]在Lancet发表的研究提供直接证据，表明持续环境内毒素暴露能诱导Th1型免疫反应，从而降低对过敏原的敏感度，并促进T细胞向Th1细胞分化，使Th1/Th2平衡，保护婴儿免受过敏原致敏。

Treg细胞在过敏性疾病发病机制中的致敏阶段发挥核心作用，在平衡T细胞分化和成熟过程中发挥重要功能。所有的Th细胞，包括Th1、Th2、Th17细胞的功能受Treg调节，在过敏性疾病的免疫调节中具有重要作用[53]。随着近年来对Treg细胞研究进展，越来越多关于环境微生物等暴露与Treg分化发育的相关性被报道。McGuirk等[54]和Wilson[55]分别报道了细菌等病原体和线虫感染有利于Treg细胞的发育。2009年Schaub等[56]研究发现，母亲农场暴露可以调节后代的免疫系统，新生儿脐带血Treg数量和功能提高，Th2相关淋巴细胞增殖减少，Th2细胞因子下降。此外，摄入农场牛奶的母亲，其后代FOXP3去甲基化增加。并且在农场暴露母亲的后代，儿童期及成年期过敏性疾病风险下降。2015年Lluis等[57]报道，在4.5岁儿童中，农场牛乳暴露通过Treg细胞数量增加、诱导调节表型起保护作用。

5 小鼠动物模型与过敏性哮喘

利用动物模型研究过敏性哮喘的免疫学机制、寻求新的防治手段具有重要意义。近年来，多项动物实验表明，病原微生物感染，甚至暴露于灭活致病微生物或其中某些单一成分，都能对过敏性疾病的发生发展产生深远影响[58]。建立反应不同保护性环境暴露的小鼠模型对于探讨保护性环境因子及其分子调控机制具有重要价值。

5.1 过敏性哮喘研究中常用小鼠模型

诱导小鼠过敏性哮喘一般包括致敏和激发两个阶段：先以特定过敏原使小鼠全身致敏，后续以相同的过敏原进行气道激发。多数研究使用卵白蛋白OVA作为过敏原进行致敏和激发，少数用屋尘螨[59]。激发后，48 h内，将小鼠暴露在浓度逐渐增加的乙酰甲胆碱中，测定小鼠气道阻力的变化[60]。

5.2 小鼠屋尘暴露模型与过敏性哮喘

由于儿童每天有较长时间在卧室度过，其卧室屋尘可在一定程度上反应环境暴露情况。利用不同来源屋尘提取物，建立低剂量持续暴露的小鼠模型，可反应环境暴露对小鼠的综合免疫调节作用。该模型比单纯使用内毒素等单体的模型更能反应环境暴露的综合作用。屋尘暴露的来源大致可分为城市和农村两种。类型可包括牛棚、马棚、鸡舍灰尘，以及有否动物暴露的家居屋尘等。屋尘暴露途径包括滴鼻和压缩泵雾化。多项研究表明，每日持续低剂量暴露可减轻气道炎症，而每周大剂量暴露可加重气道炎症[61-62]。

5.3 寄生虫感染模型与过敏性哮喘

寄生虫感染小鼠模型在过敏性疾病研究中已有大量报道。在曼氏血吸虫感染的小鼠模型中，母鼠在感染的Th1期或调节阶段交配，后代小鼠对OVA激发的气道反应显著降低[63-64]。寄生虫可通过分泌免疫调节分子调控免疫系统。例如Severine等已经鉴定了钩虫、鞭虫等可分别分泌AIP-2、P43，AIP-2通过抑制DCs上的共刺激表达及室内尘螨过敏患者T细胞的体外增殖，P43通过结合IL-13，抑制Th2应答[65-66]。然而并非所有寄生虫感染都具有保护作用，通常发生在生命早期和一些慢性感染具有保护作用；而低负担群体和一些偶发性急性感染会增强过敏反应[67]。

本课题组建立了小鼠肠道多形螺旋线虫感染模型，该模型可产生较强的Th2型免疫反应，并跨器官对肺脏炎症进行免疫调节。笔者发现，IL-10+Breg细胞通过细胞-细胞直接接触，显著促进CD4+T细胞向IL-10+Treg细胞方向增殖分化，从而抑制气道过敏性炎症[68]。

5.4 小鼠肠道菌群与过敏性哮喘

无菌小鼠缺乏肠道菌群，与传统小鼠相比其肠道基因表达、免疫系统发育不同[69]。无菌小鼠对变应原引起的气道疾病表现出更高的易感性，涉及不同机制，如IgE的增加和黏膜上嗜碱性粒细胞数量的增加等[70-71]。一些研究表明肠道寄生虫和菌群之间可能存在相互作用，因为它们都生活在同一个器官中，例如，人体寄生虫感染与菌群多样性的增加有关[72-73]。肠道菌群与疾病的关系是目前多个领域的研究热点，但寄生虫在其中是否存在重要的作用仍了解甚少，阐明寄生虫感染与肠道菌群互相协作调控过敏性疾病的分子机制是未来研究方向之一。

6 小结

过敏性疾病患病率在全球的上升趋势给社会增加了越来越多的医疗支出。欧洲农场及我国农村地区的保护性环境对于加深过敏性疾病的预防及调控机制提供了重要的对比研究模型。结合流行病学调查研究以及小鼠模型，深入探讨环境暴露因子对过敏性疾病的调控作用，有助于弥补对过敏性疾病发病分子机制的知识缺口，有助于开发新的防控措施。卫生假说提出已有30年，且在不断完善之中。结合目前本领域的研究热点，本文为后续研究方向提供新的思路。