金属蛋白酶在椎间盘退行性变中的研究进展*

周小莉 洪莹莹 詹玉林

（1上海中医药大学医学系，上海 200000，2上海海洋大学生物学系，上海 200000，3上海健康医学院附属第六人民医院东院骨科，上海 200000）

腰痛是一种极其常见的健康问题，其造成的残疾比其他任何疾病都要多，而在2010年的全球疾病负担调查中，腰痛在291个原因里高居第6位[1]。除却生理上的痛苦、经济上的压力，其亦常导致病人心理上的焦虑抑郁状态[2]。而越来越多的证据表明，腰痛与椎间盘退行性变 (intervertebral disc degeneration, IDD)密切相关。尽管椎间盘退行性变的发生机制并未完全清楚，但诸多研究提示髓核细胞外基质 (extracellular matrix, ECM) 的降解是其主要的特征性改变之一。

ECM主要成分是II型胶原和蛋白聚糖，使髓核能够保留水分，从而缓冲和吸收机体上的负荷。在健康的椎间盘中，由于生长因子和分解代谢细胞因子的复杂调节，ECM的合成和分解速率处于平衡状态，而当ECM的分解代谢超过其合成代谢时，胶原蛋白和蛋白聚糖的丢失，椎间盘退变得以发生、发展[3]。而基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和具有血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶 (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs, ADAMTSs) 是切割胶原蛋白和蛋白聚糖的主要酶，其各自成员在退行性变的椎间盘中的高表达，与ECM分解和IDD进展密切相关[4]。针对IDD的治疗，临床上仍停留在比较片面的对症处理上，待疾病恶化到一定程度则采取手术治疗，对于如何延缓甚至逆转该病的进程尚缺乏有效的手段。本文综述近年来关于MMPs和ADAMTSs在IDD中的表达和作用的报道，并总结了一些以此为基础的治疗方法的最新进展，以期为治疗该疾病提供新的思路。

1.正常椎间盘的组成及功能

椎间盘是脊柱椎体之间的功能单位，由三部分构成：坚韧的层状纤维环 (annulus fibrosus, AF)、软质凝胶状髓核 (nucleus pulposus, NP) 以及上下两端各一的软骨终板 (endplates, EP)。椎间盘各组分之间协同合作，作为椎体之间的减震器，应对脊柱的弯曲和扭转[5]。

AF由15～25个同心层组成 ，每层厚约0.05～0.5 mm，厚度从外到内逐渐增加。在健康的椎间盘中，AF含有约65%～70%的水，干重约为20%蛋白多糖，干重约50%～70%胶原，干重约2%的弹性蛋白以及其他非胶原成分。从外层向内层，蛋白多糖、水和II型胶原蛋白含量增加，而I型胶原蛋白含量降低。I型胶原蛋白可提供张力，而II型胶原蛋白形成细小的网状结构结合蛋白多糖，从而可与水结合，使组织能够承受压力[6]。

NP是胶质结构，富含II型胶原和蛋白聚糖，还包括少量的VI，IX和XI型胶原。II型胶原蛋白约占干重的5%～20%，提供松散的三维纤维网络。在蛋白聚糖中，聚集蛋白聚糖是最常见的类型，约占NP干重的50%，在吸水过程中起着关键作用，NP的高含水量使其表现出响应于压缩载荷而增加的流体静压，使其具备应对机体压力的能力[7]。

2.ECM在椎间盘退行性变过程中的变化

在健康的椎间盘中，ECM的合成和分解速率处于平衡状态，当分解超过合成时常发生椎间盘退变。通常情况下在退化的早期阶段胶原蛋白合成有所增加，NP内II型胶原合成增加较为明显，这可能意味着机体尝试进行修复机制。随着退变的进一步进行，II型胶原含量显著降低，且I型胶原在纤维内环及髓核中形成更强的韧性纤维，而蛋白聚糖的改变，特别是聚集蛋白聚糖的降解，则是退变中更为初始且关键的表现[8]。

ECM组成变化所带来的结果是对应结构的变化，包括椎间盘高度的降低及纤维环层状损害，也可能导致整个椎间盘运动节段的机械应力显着改变。聚集蛋白聚糖的降解所带来的水分的丢失，导致NP承受压力的能力下降，较高的压缩载荷转移至AF，损害其结构和功能，出现裂缝、翘曲或破裂等情况，导致椎间盘进一步损害。

3.MMPs和ADAMTSs的生物学特性

（1）MMPs的结构特点及分类

MMPs是一类钙依赖性、含锌内肽酶的一个非常大的家族，迄今为止在人体中共检验到24种基质金属蛋白酶，其中包括MMP-23基因的两个复制表达。基于底物特异性、蛋白质结构和亚细胞定位，基质金属蛋白酶可分为六类：胶原酶，明胶酶，基质溶素，基质金属蛋白酶，膜型基质金属蛋白酶和其他类型。其中胶原酶 (MMP-1、-8、-13和-18) 主要作用于纤维状胶原蛋白；明胶酶 (MMP-2和-9)作用于变性的胶原蛋白、明胶和层粘连蛋白；基质溶素蛋白酶 (MMP-3、-10和-11) 可以蛋白水解多种底物，包括蛋白多糖、明胶、胶原等；基质金属蛋白酶 (MMP-7和-26) 可作用于多种ECM组分，包括聚集蛋白聚糖，以及生长因子和细胞因子；膜型金属蛋白酶 (MMP-14、-17、-24和-25) 定位于质膜，具有影响细胞内信号传导途径的细胞质结构域，并且可能激活其他MMPs[9]。其余的金属蛋白酶 (MMP-12、-19、-20、-21、-23、-27和-28) 也参与组织基质稳态和修复，但是它们的底物特异性尚未明确。这些基质金属蛋白酶通常以非活性形式分泌，需要其他调控激活蛋白激活，这种调节确保各种基质金属蛋白酶在组织生长、修复和重塑方面具有相应的时间和空间活性[10]。

（2）ADAMTSs的结构特点及分类

ADAMTSs是较晚发现的与ECM成分结合的金属蛋白酶家族，由19名成员组成。根据其结构功能的不同，可分为四类：聚集蛋白聚糖酶、胶原蛋白N-肽酶、血管性血友病因子和其他类型。其中聚集蛋白聚糖酶 (ADAMTS-1、-4、-5、-8、-9、-15和-20)，可以粗略地描述为具有蛋白多糖分解作用，尽管还有其他报道的功能，例如调节血管生成等；胶原蛋白N-肽酶 (ADAMTS-2、-3和-14)，它们具有合成代谢功能，作用于胶原类型I，II和III的前胶原等；血管性血友病因子 (ADAMTS-13)，可参与凝血机制，并且该蛋白质的突变与血栓性血小板减少性紫癜相关；其余的ADAMTS (-6、-7、-10、-12、-16、-17、-18和-19) 功能尚不确切[11]。

4.MMPs和ADAMTSs在正常椎间盘与退变椎间盘中的表达

（1）MMPs在正常与退变椎间盘中的表达

MMPs在正常的椎间盘中表达很低，甚至没有，而少量的表达可能是由于参于正常组织的修复和重塑所致。在婴幼儿及青少年的椎间盘中，在细胞核或纤维环内几乎无MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9的免疫组化反应，而在15岁以上人群的椎间盘中检测到显著表达的MMP-1、MMP-2和MMP-3，偶可检测到MMP-9[12]。

相较于正常椎间盘，退行性变的椎间盘中可检测到更多的MMPs的表达。一项研究分析了椎间盘退变分级与MMP-1表达的关系，并比较了不同年龄组之间的差异，结果表明随着退变分级的增加，MMP-1的表达逐渐上调，且老年组椎间盘MMP-1表达明显高于青年组[13]。Takahashi等报道了椎间盘中MMP-3为响应机械负荷后的增加，且因其表达导致的椎间盘退变程度可随时间加重[14]。Maitre等证实在髓核的软骨细胞样细胞中MMP-7的表达随着组织学级别的退化加重而增加，其可降解椎间盘的主要基质分子，并伴随许多其他蛋白酶和细胞因子的激活，且对TIMP-1的抑制具有抗性，在椎间盘退化中起着重要作用[15]。Stephen等发现在有症状的椎间盘退变中MMP-10表达增加，其可能促成基质降解，并成为疼痛感受出现的开端[16]。MMP-12可在退变椎间盘中检出，其不仅参与细胞外基质的降解，且与细胞因子和趋化因子的活性相关[17]。

（2）ADAMTSs在正常与退变椎间盘中的表达

ADAMTS-1、-4、-5、-9和-15在正常椎间盘和退变椎间盘中均可存在，在正常椎间盘中表达的意义可能在于在生理功能中发挥作用，对比后发现ADAMTS-1、-4、-5、-9、-15在退变椎间盘中表达较多[18]。Patel等利用免疫印迹法比较退变早期和晚期人类椎间盘中ADAMTS-4和ADAMTS-5蛋白的表达，发现ADAMTS-4在晚期变性组织中的含量高于早期，而ADAMTS-5在两个阶段中的含量没有统计学差异[19]。Gruber等人对比了退变程度不同的椎间盘后发现，ADAMTS-3和ADAMTS-10在高程度退变的椎间盘中的表达较低程度的更低[20]。因此，在椎间盘退行性变的进程中ADAMTSs的表达模式尚不确切，仍需进一步探索研究。

5.MMPs与ADAMTSs在IDD中的调控

腰椎间盘退行性变是一个复杂且多因素的病变过程，涉及的机制尚未完全阐明，但可以明确的是由MMPs和ADAMTSs介导的ECM的降解在此过程中起着关键性的作用。目前部分文献报道了已通过实验证实的部分金属蛋白酶的作用机制，以及与其表达密切相关的通路和因子。

（1） MMPs在IDD中的调控

考虑到椎间盘在变性期发生了细胞外基质组分的碎裂，而ECM的蛋白水解片段加重了IDD。Quero等用片段透明质酸 (fragment Hyaluronic Acids, fHAs) 处理健康椎间盘细胞后发现了MMP-1和-13的mRNA高表达，此外还发现fHAs依赖于丝裂原活化蛋白 (mitogen-activated protein, MAP) 激酶信号传导通路增强MMP-3蛋白产生的能力[21]。Hsien等发现神经生长因子 (nerve growth factor, NGF) 可增加Lcn2的表达，该因子可保护MMP-9并上调表达，加大MMP-9与其抑制剂的比例，同时可以协同MMP-9来增强对基质的降解[22]。另一项研究则表明miR-146a抑制IL-1诱导的MMP-13的表达，当miR-146a 敲除小鼠的椎间盘离体培养于IL-1环境下3天后，表现出了较对照组更严重的退变，并伴随着MMP-13表达的升高[23]。

（2）ADAMTSs在IDD中的调控

大量研究证实聚集蛋白聚糖的丧失是椎间盘组织退变的早期关键变化，ADAMTS-4和ADAMTS-5由于其在切割聚集蛋白聚糖中的高效率而被归类为主要聚集蛋白聚糖酶，故而成为探索重点。Wang等证实TNF-α处理后的人类椎间盘细胞中ADAMTS-4和ADAMTS-5呈现高表达，随后通过促进NF-κB通路来刺激聚集蛋白聚糖和Col II的分解代谢[24]。另一项研究表明TNF-α和IL-1β通过SDC4通路促进ADAMTS-5的高表达来加强聚集蛋白聚糖的降解[25]。而经IL-1β处理的大鼠NP细胞表现出ADAMTS-4的高表达及聚集蛋白聚糖降解的显着增加，也归因于MAPK和NF-κB通路的激活[26]。Li等报道了肥胖症人群中瘦素 (leptin)的过度表达可以显着上调ADAMTS-4和ADAMTS-5的表达，并且通过诱导p38磷酸化来降低聚集蛋白聚糖的水平，也证实了肥胖确为IDD发病的高危因素[27]。

6.在IDD中以MMPs和ADAMTSs为靶点的治疗方法研究进展

基于前人关于金属蛋白酶的探索，近年来有许多研究以此为靶点，在化学、基因学、再生医学等多方面探寻IDD的治疗方法。

有研究表明链脲霉素诱导的糖尿病小鼠表现出NP形态的特异性退行性改变，并且MMP-13和ADAMTS-5高表达，而用戊聚糖多硫酸盐和吡哆胺的联合治疗通过降低MMP-13和ADAMTS-5水平缓解了NP的变性[28]。Sun等用NF-κB特异性抑制剂BAY11-7082作用于暴露在IL-1β中的髓核细胞，发现其可降低MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5的表达，聚集蛋白聚糖和II型胶原的低表达也得到了逆转[29]。

金属蛋白酶的组织抑制剂-1 (tissue inhibitor of metalloproteinases 1, TIMP-1) 是一种特异于MMP-3或溶基质蛋白的TIMP家族成员，已经在退化的椎间盘和软骨中被检测到，增强TIMP-1的表达可增强人退化椎间盘细胞中的蛋白多糖合成[30]。Leckie等将携带TIMP-1基因的腺相关病毒血清型2 (adenovirus associated virus 2, AAV2)载体注射到兔IDD模型的椎间盘中，结果显示椎间盘中的II型胶原含量显著增加，MRI评估的退变程度也较对照组轻[31]。由此亦可证实增加ECM的生产在延缓IDD中的益处。

间充质干细胞 (mesenchymal stem cell, MSC) 具有长期自我更新和多向分化的潜能，Miyamoto等将MSCs注射到兔的髓核中，发现其可以在椎间盘中持续存在24周，通过降低MMP-2，MMP-3、MMP-13的表达并促进II型胶原的增加，从而抑制椎间盘的退变进程[32]。一项研究已将MSC用于临床试验，在MRI的指导下将两名慢性腰痛的病人的人脐带组织来源MSC移植到相应椎间盘组织中，移植后2例病人疼痛和活动功能随即好转，视觉模拟量表 (visual analog scale, VAS) 和Oswestry残疾指数 (oswestry disability index, ODI) 评分在2年随访期间明显下降，且未观察到明显的不良反应[33]。证实了MSC移植在IDD治疗中的可行性。

此外，近年来中医药以金属蛋白酶为媒介，在IDD治疗方面的研究亦取得了长足进展。Yang等用大鼠制备补肾活血方血清，以体外实验方法作用于人退变椎间盘NP细胞，结果显示MMP-3和ADAMTS-5蛋白水平显著降低，而蛋白聚糖和II胶原蛋白水平增加[34]。Huang等发现五倍子酸可通过调节NF-κB信号通路中p65的磷酸化和乙酰化来降低鼠髓核细胞中ADAMTS-4的表达，从而延缓椎间盘退变的进程[35]。而虫草素可通过抑制NF-κB通路激活的方法降低退化NP细胞中ADAMTS-4、-5的表达来减轻椎间盘退化程度[36]。

7.结论

综上所述，ECM的降解确为椎间盘退变中的关键环节，金属蛋白酶在其中的作用也不言而喻。应对方法旨在通过增加合成代谢或降低分解代谢来调节基质的平衡以避免IDD或延缓其进程。结合相关研究看来，尽早采取措施来减少分解代谢的益处是明确的，同时需考虑到在退化的、机械应力改变的环境中促进椎间盘细胞合成代谢所面临的困难。另外，细胞外基质不仅存在于椎间盘组织中，而金属蛋白酶在整个身体中均发挥了重要作用，针对MMPs和ADAMTSs的抑制必须是具有组织特异性的，并准确定位于椎间盘。目前研究主要以动物定点注射和人类组织体外培养为主，在人类椎间盘内直接注射可能导致的意外也需慎重考虑，而全身给药能否达到足够、有效的椎间盘内浓度也是需探索的方向。另外，选择治疗手段时，对病人症状的治疗也不可忽视，应以提高病人的生活质量为首要目标。值得欣喜的是，祖国传统医学为这一疾病的治疗研究提供了更广阔的空间，这也将是未来着重探索的方向。