不同诱导条件对树鼩骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响*

苗雨润 李 娜 匡德宣 宋庆凯 袁 圆王 璇 张志成 陆彩霞

（1.中国医学科学院/北京协和医学院，医学生物学研究所，云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，昆明 650118）（2.河套学院医学系，内蒙古自治区蜱媒人畜共患传染病重点实验室，巴彦淖尔市 015000）

树鼩骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）具有广泛的多分化潜能，可通过如化学药物、物理环境改变、细胞因子等多种方式诱导其分化[1]。其具有来源广泛、病原微生物感染率低，生物学性能稳定、免疫原性较低和负性免疫调节作用，同种异体移植免疫排斥反应较低，不产生移植物抗宿主病等优点[2]，是自体干细胞移植治疗和构建组织工程器官的理想种子细胞，为组织工程学与再生医学提供了新思路。树鼩作为一种新型实验动物，由于其在分类学上比啮齿类与人类更相近，且繁殖饲养难度要简单于猕猴类，近年来受到广泛关注，被广泛应用于人类疾病模型的构建及相关领域的研究[3]，我们之前已成功将树鼩BM-MSCs进行了分离培养及鉴定，但由于不同物种的BM-MSCs对相同诱导剂反应性的不同，树鼩BM-MSCs向成骨诱导过程中，市售的其他物种的成骨诱导液均不能很好地达到成骨诱导的目的，现有的间充质干细胞成骨诱导分化培养基存在对树鼩骨髓间充质干细胞诱导效率不理想、成骨诱导分化的专一性不强、无法成功诱导成骨分化的问题。所以我们一直致力于寻找可以应用于树鼩BM-MSCs诱导分化为成骨细胞的最高效的诱导方法[4]。本实验初步探讨了不同浓度的化学药物及细胞因子对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化能力的影响并加以鉴定，研究其形态特征和反应性差异，探索树鼩BM-MSCs向成骨细胞分化的最佳诱导培养方法，有望开发一种针对树鼩BM-MSCs的成骨诱导分化培养鉴定的试剂盒，为树鼩骨髓BM-MSCs应用于人类相关疾病的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

F1代成年树鼩雌雄不限，体质量110～130 g，来自中国医学科学院医学生物学研究所，实验动物生产许可证 SCXK（滇）K2013-0001，使用许可证SYXK（滇）K2013-0001。

1.2 主要试剂及仪器

人淋巴细胞分离液（灏洋生物制品有限公司，天津），DMEM/F12（Thermo，美国），高糖 DMEM（HyClone，美国），DMEM（HyClone，美国），胎牛血清（HyClone，美国），地塞米松（Enzo，美国），维生素 C（Solarbio，北京），β-磷酸甘油钠（Sigma，美国），DMSO（Sigma，美 国），茜 素 红 （Solarbio，北 京），BMP-2（PeproTech，美国），碱性磷酸酶试剂盒（西亚试剂，山东），胰酶（BI，以色列），肝素钠（Sigma，美国），青霉素（HyClone，美国），链霉素（HyClone，美国），倒置显微镜（Nikon，日本），二氧化碳孵箱（Thermo，美国）。

1.3 BM-M SCs细胞

由本实验室分离鉴定保存[4]。

1.4 实验方法

1.4.1 树鼩BM-MSCs成骨细胞诱导：取第3代树鼩BM-MSCs，0.25%胰酶消化后以1x104个/m L接种12孔板，常规培养基培养细胞贴壁融合至90%后，分7组进行诱导，各组培养液配方参照表1。每隔48 h换液，诱导18 d后进行碱性磷酸酶和茜素红染色。

表1 诱导培养液的配方优化Table 1 Optim ization of form ulation of differetiation cultu rem edium

1.4.2 茜素红染色：分别取P3代细胞和P3代诱导培养18 d的7组细胞，用 PBS（pH7.2～7.4）洗2～3次，每次2 min；95%乙醇室温固定10 min，双蒸水洗涤3次；1%茜素红-Tris-HCL，每孔 500～1 000 μL，37 ℃，30 m in；双蒸水洗涤 4 次，每次 5 m in；加入双蒸水1 m L，显微镜下观察。

1.4.3 碱性磷酸酶染色：分别取P3代细胞和P3代细胞诱导18 d后的7组细胞，用PBS（pH7.2～7.4）洗2～3次，每次2 m in；95%乙醇室温固定10 m in，双蒸水洗涤3次；用碱性磷酸酶试剂盒染色，双蒸水洗涤4次，每次5 min；加入双蒸水1 mL，显微镜下观察。

2 结果

2.1 树鼩BM-M SCs在不同诱导条件下向成骨细胞分化的碱性磷酸酶染色结果

P3代树鼩BM-MSCs在不同诱导条件下体外成骨诱导18 d后，ALP染色结果见图1。如图1所示，加入成骨诱导液的P3代细胞，在进行成骨诱导18 d后，碱性磷酸酯酶染色大多为阳性（图1）。说明树鼩BM-MSCs成骨诱导18 d，已具有成骨细胞的特征。由于ALP染色步骤及方法完全相同，故采用染色深浅度作为衡量分化优劣的标准，结果显示不同组别的ALP染色结果差异较大，可以看出A、B组的染色结果明显优于其余五组，这说明这两组诱导培养液更适于树鼩BM-MSCs的体外成骨诱导培养。

2.2 树鼩BM-M SCs在不同诱导条件下向成骨细胞分化的茜素红染色结果

图1 树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导第18天后碱性磷酸酶染色结果Fig.1 Ostepgenic induction of Tupaia bone m ar row m esenchym al stem cells at 18 d by alkaline phosphatase staining

图2 树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导第18天后茜素红染色Fig.2 Ostepgenic induction of Tupaia bone m arrow m esenchym al stem cells at 18 d by alizarin red staining.

P3代树鼩BM-MSCs分别在不同组别诱导培养液的条件下体外成骨诱导18 d后，茜素红染色结果如图2所示。加入成骨诱导培养液的P3代BMMSCs细胞，其细胞形态由梭形形态逐渐转变为三角形、方形、鳞片状等，在成骨诱导18 d时形成钙化结节，茜素红染色阳性（图2）说明此时树鼩 BM-MSCs成骨诱导成功，已形成成熟的成骨细胞。在 A、B、C、D、E组都观察到有不同数量程度的明显的钙化结节，这证明树鼩BM-MSCs被成功地诱导为成熟的成骨细胞。但组别不同，其诱导程度也呈现明显差异。通过血球计数板计算在相同细胞数的前提下有多少个矿质结节形成作为评价分化标准，结果显示A、B组诱导培养液的诱导效果明显优于其余五组诱导培养液，此染色结果与 ALP染色结果基本相同，说明A、B这两组培养液的诱导效率更佳。

3 讨论

BM-MSCs可以通过不同的方法诱导为成骨细胞，其相关实验的可行性在人、大鼠、小鼠、兔、犬、猴、山羊等不同物种间先后得到验证[5]。王善正等[6]通过用自体富血小板血浆在体外培养兔的BMSCs，发现经自体激活富血小板血浆诱导的 BMMSCsⅡ型胶原α1链基因和聚集蛋白聚糖基因表达明显增高，证明自体激活富血小板血浆具有促进兔BM-MSCs向软骨细胞方向分化的潜能。近年来使用中药成骨诱导骨髓间充质干细胞也是一大研究热点，武密山等[7]，顾巧丽等[8]，及杨渊等[9]分别使用川续断皂苷VI、姜黄素及柚皮甙成功实现不同动物的BM-MSCs向成骨细胞的诱导。黄晓丹等[10]发现雷奈酸锶可通过TGF-β1/Smad通路促进大鼠BMMSCs向成骨细胞分化。此外还有许多方法可以将BM-MSCs成骨诱导，现最经典也是最常用的诱导方法有两种，即地塞米松与β-磷酸甘油钠作为诱导物及使用BMP-2作为诱导物进行诱导培养。有报道证明，BMP-2的激活渠道包括Smads途径与MAPKs途径[11]。BMP-2的信号通过这两条途径均可传入细胞，激活转录因子 Dlx5，Cbfa1和 Osx，来启动成骨细胞特异性的基因表达[12]。而化学诱导培养液中的地塞米松的作用是抑制细胞增殖，限制细胞分化，并通过激活Osx来实现信号传导，从而实现诱导分化功能。β-磷酸甘油钠的主要功能是为细胞形成矿物结节提供磷元素，维生素C则与在矿化结节的形成过程中的胶原合成直接相关[13]。本研究选择了最常用也是公认诱导效率最高的这两种方法进行研究，来探索将树鼩BM-MSCs诱导分化为成骨细胞的最佳配比的诱导培养液。

本研究采用本实验室分离保存的树鼩BMMSCs，使用7种不同配比的诱导培养液对树鼩BMMSCs进行成骨诱导培养，并使用ALP染色及茜素红染色的方法来鉴定诱导结果及不同诱导培养液的诱导效率。通过ALP染色及茜素红染色的结果来评估成骨诱导分化结果，结果显示 A组及 B组在ALP染色结果中比其余各组阳性染色结果更佳，且在相同计数细胞的前提下可以形成更多的矿质结节。化学药物抗坏血酸、地塞米松及β-磷酸甘油钠和细胞因子BMP-2都可以将树鼩BM-MSCs诱导为成骨细胞，但不同配比的诱导结果具有显著差异。结果显示，高糖DMEM培养液相对于 DMEM/F12培养液来说更适合作为诱导培养液的基础培养液。100μmol/L维生素 C+1μmol/L地塞米松 +10 mmol/Lβ-磷酸甘油钠的配比配制（即A组）的诱导培养液在诱导培养18 d后，ALP染色阳性，呈现大量的钙化结节，其诱导结果显著优于其他化学药物诱导组，是树鼩BM-MSCs诱导分化为成骨细胞的最适合的化学药物诱导培养液。细胞因子方面，50ng/m L的BMP-2即可成功将树鼩BM-MSCs诱导为成骨细胞，BMP-2浓度过高并不见得具有更佳的诱导作用。A组化学药物诱导培养液与B组（50ng/m L的BMP-2）细胞因子诱导培养液两者间的诱导结果并无显著差异，值得一提的是，D组培养液结合维生素C、β-磷酸甘油钠及 BMP-2两种不同类型的诱导物，并没有呈现更佳的诱导结果，出现这种情况也许与两者的浓度配比有关，也不排除是由于缺少地塞米松的刺激，也有可能是这两种不同类型的诱导物有拮抗作用，具体原因仍需要相关实验验证。

本研究通过对比不同诱导条件对树鼩BMMSCs向成骨细胞分化的影响，探讨最适配比的诱导培养液配方，实验结果为树鼩BM-MSCs向成骨细胞分化的相关研究提供了一定的指导依据，为开发针对树鼩BM-MSCs的成骨诱导分化培养及鉴定的试剂盒提供实验依据，也为树鼩BM-MSCs应用于人类相关疾病研究奠定了基础[14]。