NaCl、KCl和葡萄糖对大鳞鲃精子活力的影响

丁辰龙，王宣朋，李 康，覃宝利，叶建勇，蔺玉华

（1. 江苏省农业科学院宿迁农科所，江苏宿迁 223800；2.河南师范大学生命科学学院，河南新乡 453007）

大鳞鲃（Barbus capito）隶属鲤形目（Cypriniformes）鲤科（Cyprinidae）鲃属（Barbus）[1]，具有耐盐碱、食性广、肉质好、生长快速等优良性状[2]，是贵重的大型经济鱼类.为了改变我国东北、华北和西北地区盐碱水域养殖品种单一、缺乏优质鱼类的情况，2003年本课题组将大鳞鲃从乌兹别克斯坦引入我国[2].2008年，江苏省农业科学院宿迁农科所首次引进大鳞鲃，在苏北淡水池塘养殖.大鳞鲃原种最初进行繁殖时，雌鱼17尾，雄鱼仅有3尾.养殖10年内，大鳞鲃繁育群体的雌雄比例约为3∶1，在繁殖高峰期，常常出现雄鱼数量不够、精子成熟度较差的现象.精子活力与受精率有密切关系，在大鳞鲃雄鱼精子数量不足的情况下，提高精子活力是得到高受精率的重要途径[3-5].Na、K、葡萄糖等不仅是鱼类精浆的重要成分，也是构成精浆渗透压的主要物质[6]，它们也是鱼类人工繁殖过程中精子保存液的主要成分.研究这些物质对大鳞鲃精子活力的影响，对于提高其受精率和孵化率具有重要意义.

有关鱼类精子活力的研究报道较多[7-11]，不同鱼类的精子有不同的抑制与激活机制，这是鱼类精子自身的生理特性以及环境适应的结果[12]，如不同科、属的鱼类对盐度要求范围差异较大[13].关于大鳞鲃精子生理活性方面的研究较少，仅见徐敏等[13]关于钠盐对精子活力影响的报道.然而，对精子活力影响的因素较多，除了电解质，还有非电解质因素.为此，本课题组研究了钠盐、钾盐和葡萄糖对大鳞鲃精子活力的影响，旨在探索保持大鳞鲃精子活力的最适宜盐度范围和营养需求.

1 材料与方法

1.1 亲鱼来源与精液采集

2017年5月份，在江苏省农业科学院宿迁农科所繁育基地，选取健康、体表鳞片完整的性成熟4龄大鳞鲃雄鱼为亲鱼，平均体长为（46.97±2.53）cm，平均体质量为（1.49±0.17）kg.每个实验组有3尾鱼，对其腹部注射一次催产剂.催产药物为宁波生物制药三厂生产的鱼类催产激素，具体组分及每千克鱼的剂量：促黄体释放激素（LRH-A2）2 μg、马来酸地欧酮（DOM）1 mg、绒毛膜促性腺激素（HCG）0.9 mg（200 IU）.注射了催产药物的雄鱼放入暂养桶中，水温23～25℃，催产后10～14 h取精液.采精时，擦干鱼的生殖孔，轻压腹部，用1 mL注射器抽取精液，放入干燥离心管中（用潮湿纱布盖上，以防精子失水）.抽取的精液呈乳白色，无血、尿、粪便和黏液污染.每个实验重复3次，取平均值，检测精子活力时稀释液温度为24～26℃.

1.2 方法

以去离子水为溶剂，分别配制NaCl、KCl和葡萄糖（均为分析纯级）溶液，质量浓度分别为 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 g/L.按照精液与盐溶液体积比为 1 ∶200进行混合，取20 μL精子混合液滴入载玻片上，使用10×10倍显微镜观察，以一个视野为准.精子活力等级的划分依据文献[14]，略加改进.从精液与稀释液相混合开始计时，精子呈“漩涡”状运动，约100%的精子被激活时为精子激烈运动时间；约70%的精子（分路运动）转入中速运动时为精子快速运动时间；约95%的精子停止运动时为精子寿命终止时间.

1.3 数据处理与分析

2 结果与分析

2.1 NaCl对精子活力的影响

不同质量浓度的NaCl溶液中大鳞鲃精子的活力如表1所示.

表1 不同质量浓度的NaCl溶液中大鳞鲃的精子活力Tab.1 Sperm motility of Barbus capito in NaCl solutions with different mass concentrations s

由表1可以看出，随着溶液中NaCl质量浓度的增加，大鳞鲃精子的激烈运动时间（约100%的精子被激活，呈“漩涡”状运动）、快速运动时间（约70%的精子分路运动）和寿命（约5%的精子原地颤动）均先增加，在NaCl质量浓度为5 g/L时达到最大值，快速运动时间为（52.5±4.2）s，寿命达到（92.5±3.3）s.随着NaCl质量浓度的进一步增加，精子活力下降.盐度为8 g/L时，精子快速运动时间仅有（9.2±1.6）s，为峰值的17.5%，寿命为（26.6±2.6）s，为峰值的 28.8%.NaCl质量浓度达到9 g/L时，精子只是原地颤动，加入去离子水后又开始运动，即该质量浓度的NaCl溶液可以用于保存大鳞鲃精子；NaCl质量浓度为10 g/L时，精子很快死亡，即使再加去离子水，精子也不被激活.由此可知，NaCl溶液的质量浓度为5 g/L时，大鳞鲃精子活力最高.

2.2 KCl对精子活力的影响

不同质量浓度的KCl溶液中大鳞鲃精子的活力如表2所示.

表2 不同质量浓度的KCl溶液中大鳞鲃的精子活力Tab.2 Sperm motility of Barbus capito in KCl solutions with different mass concentrations s

由表2可以看出，KCl质量浓度为0～6 g/L时，大鳞鲃精子活力随着KCl质量浓度的增加呈上升趋势，当KCl质量浓度为6 g/L时，精子的激烈运动时间、快速运动时间和寿命均最长.随着KCl质量浓度的进一步增加，大鳞鲃精子活力下降.KCl质量浓度为9 g/L时，精子原地颤动，加去离子水后精子被激活，即该质量浓度的KCl溶液也可用于大鳞鲃精子的保存；KCl质量浓度为10 g/L时，加去离子水精子未被激活，说明精子已死亡.由此认为，KCl质量浓度为6 g/L时大鳞鲃精子的活力最大.

与NaCl溶液相比，KCl溶液中大鳞鲃精子的激烈运动时间略低，其最大值略低于NaCl溶液中的数值，但是精子的快速运动时间和寿命均高于NaCl溶液中的数值，尤其是寿命，最大值达到了（309.6±16.0）s，而NaCl溶液中的精子最长寿命仅为（92.5±3.3）s.鱼类受精过程中，只有70%快速运动的精子可以穿过卵膜，具有与卵结合的能力，因此认为，KCl溶液更适合于激活大鳞鲃精子.

2.3 葡萄糖对精子活力的影响

不同质量浓度的葡萄糖溶液中大鳞鲃精子的活力如表3所示.

表3 不同质量浓度的葡萄糖溶液中大鳞鲃的精子活力Tab.3 Sperm motility of Barbus capito in glucose solutions with different mass concentrations s

由表3可以看出，葡萄糖质量浓度为0～5 g/L时，大鳞鲃精子活力随着葡萄糖质量浓度的增加而逐渐增加，在5 g/L时，精子的激烈运动时间、快速运动时间和寿命均达到最大，分别为（26.4±1.3）s、（33.2±2.6）s和（55.4±1.8）s.葡萄糖质量浓度进一步增加，精子活力下降.由此可见，葡萄糖溶液的质量浓度为5 g/L时最有利于大鳞鲃精子活动.总之，大鳞鲃精子在不同质量浓度的葡萄糖溶液中，活力的变化幅度明显小于在NaCl或KCl溶液中的数值，即葡萄糖对大鳞鲃精子活力的影响小于NaCl和KCl.

3 讨论与结论

对淡水鱼类而言，渗透压是影响鱼类存活的主要因素，也是精子维持活力的主要因素，鱼类大部分能量消耗在渗透压调节上[11-12].若精子处于等渗环境中，原来用于调节渗透压的能量可转用于维持其活动，活动时间必将延长.本研究配制的质量浓度为5 g/L的NaCl溶液，其渗透压接近严安生等[11]研究发现的淡水鱼类精子原生质的渗透压（170 kPa），在此环境下大鳞鲃精子的激烈运动时间、快速运动时间和寿命均达到最大.在鱼类繁殖过程中，延长精子快速运动时间能够为精子与卵子相遇赢得更多机会，从而提高受精率.

Na+、K+是精浆的重要组分和形成精浆渗透压的主要离子.通常情况下，鱼类精子在精巢中是不运动的，但具有潜在运动能力[13].盐度通过离子作用和渗透压调节并影响cAMP-ATP-Mg2+系统的运行，进而影响精子鞭毛的活动[15-17].在盐度相对较低的溶液中，精子内ATP的产生和消耗在一段时间内可达到平衡，因此精子能够维持较长寿命；而高盐浓度的溶液中，ATP酶活性被抑制，从而使精子活力下降[18].本研究中，大鳞鲃精子在NaCl质量浓度为0～5 g/L或KCl质量浓度为0～6g/L的溶液中时，精子活力随盐度的升高而升高，NaCl或KCl的质量浓度为3～6 g/L时，精子快速运动时间和寿命较长，为最适盐度范围；溶液中NaCl或KCl的质量浓度大于8 g/L时，精子活力明显降低，达到9 g/L时，大鳞鲃精子开始停止运动，但一旦加入去离子水后，精子又开始快速运动，因此可在此盐度下保存大鳞鲃精子；当NaCl或KCl的质量浓度超过10 g/L时，精子不再运动，即使加入去离子水，精子仍然不运动，说明精子此时已经死亡.这可能是因为溶液与精子细胞质中的渗透压相差太大，精子自身的能量全部用于调节渗透压，能量消耗殆尽以致死亡，也可能是由于渗透压太大，直接导致精子的细胞结构受损而死亡[19].本研究中NaCl的质量浓度为5 g/L时大鳞鲃精子的快速运动时间和寿命最长，与徐敏等[13]的研究结果略有不同（NaCl最佳质量浓度为4 g/L），这可能是由于实验用大鳞鲃雄鱼的年龄不同，本研究中为4龄鱼，徐敏等的研究中为6龄鱼.

本研究首次探究了KCl对大鳞鲃精子活力的影响，发现在6 g/L的KCl溶液中，精子的快速运动时间和寿命均长于其在5 g/L NaCl溶液中的数值，这与宋勇等[7]对彩鲫精子活力的研究结果相近.在海水鱼类和某些鲑科鱼类中，K+有抑制精子活力的作用[20-21]，然而在淡水鱼类中，K+能增强鲤、欧鲫、花、雅罗鱼、团头鲂等精子的活力，延长其寿命，并提高精子运动速度[22-23].Na+和K+对精子活力的影响因鱼的种类而异，且存在较大差异，其机制有待进一步研究.

鱼类精液中的碳水化合物主要是葡萄糖.体外受精鱼类的精子具有三羧酸循环代谢的能力，鱼类精子可以通过氧化作用利用细胞外源性化合物，尤其是葡萄糖、半乳糖和果糖[8].严安生等[8，11]研究发现，鲤、团头鲂精子在葡萄糖溶液中的快速运动时间和寿命均长于其在NaCl或KCl溶液中的数值；宋勇等[7]发现，彩鲫精子在质量浓度为1.5 g/L的葡萄糖溶液中时，精子寿命比最佳浓度的NaCl溶液中的寿命长约350 s.这些研究表明，葡萄糖这种延长精子存活时间的作用不仅与渗透压调节有关，也与溶质自身密切相关，即体外受精鱼类的精子具有利用细胞外源性单糖来补偿自身能量消耗的能力.本研究中，大鳞鲃精子活力在不同质量浓度的葡萄糖溶液中的变动幅度小于无机盐溶液，说明葡萄糖对大鳞鲃精子活力的影响弱于无机盐.在5 g/L的葡萄糖溶液中精子快速运动时间和寿命最长，但数值低于其在NaCl或KCl溶液中的最大值，具体机制有待进一步探讨.