本氏烟DnaJ-like蛋白在芜菁花叶病毒侵染过程中的作用

孙超尘，燕 飞，陈剑平，*

(1.云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650201；2.浙江省植物有害生物防控国家重点实验室培育基地，农业农村部植保生物技术重点实验室，浙江省植保生物技术重点实验室，浙江省农业科学院 病毒学与生物技术研究所，浙江 杭州 310021)

热休克蛋白40(heat shock protein 40，HSP40)广泛存在于生物界，是一类进化上高度保守的蛋白。其家族含有保守的J结构域，因此又被称为DnaJ蛋白，其同源蛋白被称为DnaJ-like蛋白。DnaJ-like蛋白发挥二硫化物异构酶作用催化蛋白二硫化和异构化[1]，亦可作为分子伴侣协助HSP70发挥作用[2]，参与生物体蛋白折叠、装配、运输、降解、信号转导、mRNA剪接等多种生理过程。如大豆中的DnaJ-like蛋白可调控细胞死亡与抵抗疾病[3]；拟南芥中的DnaJ-like蛋白可调控向光素介导的叶绿体运动以参与光信号转导，还可与细胞骨架相互作用调节重力信号传输[4]；在哺乳动物及人体中，DnaJ蛋白可以促进卵巢生成雌性激素[5]，并作为肿瘤诊断指标[6-7]。DnaJ-like蛋白对于抵抗高温、干旱、盐胁迫及缺氧等逆境胁迫也具有重要意义[8-9]。

DnaJ蛋白具有约70个氨基酸组成的保守J结构域，核心结构为组氨酸/脯氨酸/天冬氨酸(His/Pro/Asp，HPD)三肽，根据结构差异分为3种类型[10]。A类亚家族蛋白包含4种结构域：N端的DnaJ 结构域，富含甘氨酸和苯丙氨酸结构域(G/F结构域)，含有4个Cys-X-X-Cys-X-Gly-X-Gly基序的富含半胱氨酸(CRR)结构域(G/F与CRR结构域亦被视为类锌指基序)和不保守的C末端结构域(CTD)；B类亚家族蛋白包含除CRR结构的3种结构域；C类亚家族蛋白具备DnaJ结构域与CTD结构域，可能包含细胞器定位序列、内质网滞留序列、法尼基化信号等不同结构域。

研究表明，DnaJ-like蛋白响应多种病毒的侵染，但发挥的作用各不相同。在临床医学研究中，发现DnaJ家族蛋白Hdj1和hTid1与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)相互作用并可能抑制病毒复制[11]；而DnaJ家族蛋白Hdj2直接与日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)的NS5相关并促进病毒复制[12]。植物中，DnaJ蛋白突变抑制了雀麦花叶病毒(Brome mosaic virus，BMV)的负义链RNA合成[13]。烟草cDNA文库中鉴定出一类DnaJ家族蛋白NtMPIP1，与烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)的运动蛋白互作，沉默该基因抑制了病毒的传播[14]。用酵母双杂交对水稻cDNA文库进行筛选，得到与水稻条纹病毒(Rice stripe virus，RSV)的运动蛋白PC4互作的DnaJ类蛋白[15]。在番茄、拟南芥和普通烟草中发现了与番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)运动蛋白互作的DnaJ蛋白，推测其可能参与病毒运动[16]。马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PYV)的外壳蛋白招募寄主DnaJ蛋白协助病毒侵染，在酵母双杂交实验中发现与TSWV互作的DnaJ蛋白并不能与PVY互作，反之亦然[17]。在本氏烟中鉴定得到一个DnaJ蛋白，该蛋白可以与马铃薯X病毒(Potato virus X，PVX)的外壳蛋白相互作用，过表达或缺失该蛋白基因都抑制了病毒的运动和复制[18]。

芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus，TuMV)在分类上属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，其寄主范围广泛，危害程度严重，给全球蔬菜生产造成了极大经济损失[19-20]。TuMV主要由蚜虫传播，在不同寄主植物上产生花叶、坏死和矮化等不同类型症状，不同的病毒株系造成病毒症状也不同[21]。其病毒粒子呈弯曲线形，大小为(700～800) nm×(15～20) nm，螺旋对称[22]。全基因组为一条正义链单链RNA[23]，长为9 798～9 844个核苷酸，编码一个大的开放阅读框(open reading frame，ORF)，两端各有一个非翻译区(untranslated region，UTR)，通过多聚蛋白策略和核糖体移码策略编码等表达11个结构和功能不同的成熟蛋白[24]，从5′端起依次为P1、HC-Pro、P3、P3N-PIPO、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、NIb-Pro和CP蛋白。

目前，关于DnaJ-like蛋白是否响应TuMV侵染，是否在TuMV侵染过程中执行某种作用尚不清楚。本研究对此开展工作，期望能够明确该家族蛋白在TuMV侵染过程中的作用，为深入了解病毒致病和植物抗病毒机制提供理论数据，也为开辟绿色安全的防治手段提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

野生型本氏烟(Nicotianabenthamiana)种子为实验室保存，种植土壤条件为蛭石、营养土体积比为1∶1，25 ℃恒温培养，光周期16 h/8 h (L/D)，水分适中。

大肠埃希菌菌株Trans5α/T1、pEASY-Blunt Zero克隆载体购自全式金生物有限公司，其他供试菌株及载体为本实验室保存。烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)侵染性克隆载体(pYL192)由清华大学刘玉乐教授提供。

1.2 实验方法

1.2.1 RNA提取和本氏烟DnaJ基因克隆

采用Trizol法提取本氏烟总RNA，经三氯甲烷抽提、异丙醇沉淀、75%乙醇清洗等过程，得到RNA，冻存于-80 ℃备用。

将所得本氏烟RNA按照Takara反转录试剂盒说明反转录为cDNA，以此为模板，利用Primer 3 plus在线工具设计引物，引物见表1，采用KOD高保真酶(TOYOBO)进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增得到目的片段。

按照pEASY-Blunt Zero克隆载体说明书将PCR产物与载体连接，42 ℃热激90 s转化大肠埃希菌菌株Trans5α感受态细胞，PCR检测为阳性的菌液送杭州擎科梓熙生物技术有限公司测序，鉴定阳性单克隆并抽提质粒，-40 ℃保存备用。

1.2.2 初步生物信息学分析

将获得的基因序列在NCBI和SOL GENOMIC数据库中进行同源比对，使用DNAMAN、ClusalIX、MEGA等软件工具分析所得序列同源性。

1.2.3 本氏烟系统沉默基因

利用TRV介导的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)技术在本氏烟中沉默目的基因。

以1.2.1节所得阳性克隆质粒为模板，利用SOL GENOMIC数据库工具选定VIGS区段，设计引物，采用不依赖连接反应的克隆法(ligation-independent cloning，LIC)构建TRV沉默载体，检测鉴定阳性单克隆并抽提质粒冻存。将载体质粒转化入根癌农杆菌EHA105，注射本氏烟，沉默植株内源基因。观察植物沉默表型，检验TRV载体，并参照Vazyme公司说明书利用实时荧光定量PCR检测系统(real-time quantitative PCR detecting system，qPCR)检测目的基因表达水平，所用引物见表2。

1.2.4 分子生物学技术检测病毒含量

在本氏烟上注射TuMV-GFP侵染性克隆，发病后取植物总RNA并检验病毒，用qPCR检测植物DnaJ家族基因的表达量变化，相关引物如表3所示。

表2 VIGS载体构建相关引物序列

在本氏烟沉默目的基因后，接种TuMV，持续监测植株变化。分别于3.5、6.0 d对实验组和对照组植株接种叶和系统叶拍照取样，并取样品参照《分子克隆》所述方法做Western blot检测，在蛋白水平检测病毒含量变化。

表3 TuMV和DnaJ-like基因检测引物序列

2 结果与分析

2.1 本氏烟DnaJ基因克隆

根据参考文献和数据库对DnaJ基因的报道设计引物，在本氏烟中克隆得到16条DnaJ基因，命名为NbJ1～NbJ14，其中NbJ12和NbJ14各有2条序列，ORF仅有个别氨基酸差异，将它们的第二条序列命名为NbJ12-2和NbJ14-2。在NCBI数据库中查找基因序列的ORF，翻译为蛋白质，利用DNAMAN和ClusalIX进行多序列比对，在MEGA5中采用临接算法(neighbor-joining，NJ)将这些蛋白序列构建为进化树。这些蛋白都具有保守的J结构域和G/F结构域，彼此之间有较高相似性，聚类分析显示，NbJ3～NbJ6蛋白序列属于DnaJ蛋白的A类亚家族，其他NbJ蛋白序列属于B类亚家族(图1-A)。挑选2类亚家族的典型蛋白NbJ5和NbJ1，分别与NCBI数据库中不同物种的该家族蛋白做同源性分析。结果显示：DnaJ蛋白A类亚家族的NbJ5与立枯丝核菌等真菌和光滑爪蟾等动物中的DnaJ蛋白具有较高同源性，与草莓、棉花等植物来源的DnaJ蛋白同源性低于上述序列；B类亚家族中的NbJ1则与普通烟、棉花、山萮菜等植物的DnaJ蛋白同源性较高，与真菌、动物等来源的DnaJ蛋白亲缘关系较远；NbJ5和NbJ1与细菌来源的DnaJ蛋白在分析中均显示了较低同源性(图1-B与图1-C)。

A，NbJ1～NbJ14，NbJ12-2和NbJ14-2系统进化分析；B，NbJ5与其他生物中DnaJ-A家族蛋白系统进化分析；C，NbJ1与其他生物中DnaJ-B家族蛋白系统进化分析；D，NbJ1和NbJ5与已报道的病毒侵染相关DnaJ蛋白系统进化分析。A，Phylogenetic analysis of NbJ1-NbJ14，NbJ12-2 and NbJ14-2; B，Phylogenetic analysis of NbJ5 and DnaJ-A family proteins from other organisms; C，Phylogenetic analysis of NbJ1 and DnaJ-B family proteins from other organisms; D，Phylogenetic analysis of NbJ1，NbJ5 and the reported virus infection-related DnaJ proteins图1 基于蛋白序列的本氏烟DnaJ-like系统进化分析Fig.1 Phylogenetic relationships of N.benthamiana DnaJ-like proteins based on sequence alignments of the proteins

在NCBI中对NbJ1～NbJ14、NbJ12-2和NbJ14-2进行氨基酸比对，发现DnaJ蛋白A类亚家族的NbJ5与数据库显示的本氏烟中MIP1.3基因编码的蛋白完全相同，该蛋白为一类协助TMV侵染植物的DnaJ蛋白[25]。而B类亚家族的NbJ1与本氏烟中与PVX侵染相关的DnaJ蛋白PSL1IP2具有高度相似性[18]，与普通烟中与TSWV运动蛋白NSm相互作用的DnaJ蛋白NtDnaJ-M541也具有较高的相似性[16]，同源性分析结果如图1-D所示。

2.2 寄主DnaJ基因对TuMV侵染的响应

在本氏烟上注射TuMV-GFP侵染性克隆，系统叶出现黄化、卷曲、斑驳等症状。图2-A显示了接毒15 d后植株的发病情况，图2-B为特异性引物检测TuMV结果。以Mock为对照组，取接毒15 d植株与对照植物对应叶位的叶片，选择DanJ家族保守区设计引物，用qPCR检测植物内源DanJ家族基因表量的变化。采用相对定量2^-△△Ct法分析定量数据，结果如图2-C所示，接种TuMV的植株中DnaJ基因表达量明显上调。

A，左图为接种TuMV 15 d的实验组植株，其系统叶出现卷曲、黄化和斑驳等症状，右图为对照组植株生长表型；B，利用TuMV特异性引物做PCR检测，显示实验组植株被TuMV成功侵染，而对照组植株未被TuMV侵染；C，qPCR检测本氏烟被TuMV侵染后DnaJ-like基因相对表达水平。A，The left picture showed the symptoms of systemic leaf on N.benthamiana infected by TuMV at 15 d，the right picture showed the growth phenotype of control plants; B，PCR cornfirmed the infection of TuMV; C，qPCR showed the up-regulated expression of DnaJ-like genes in TuMV-infected plants.图2 DnaJ-like基因响应TuMV侵染Fig.2 DnaJ-like gene responded to TuMV infection

2.3 沉默NbJ1和NbJ5基因的本氏烟表型

利用TRV介导的VIGS技术在本氏烟中沉默目的基因，首先在SOL GENOMIC数据库中选定目的基因上约300 bp的区段作为VIGS区域，利用LIC技术构建了沉默载体TRV∶NbJ1与TRV∶NbJ5。然后选定长势相近的植株，实验组注射含有沉默载体TRV∶NbJ1或TRV∶NbJ5的农杆菌，对照组注射含有TRV∶GUS载体的农杆菌，指示植物组注射含有TRV∶PDS载体的农杆菌(沉默PDS基因的植株出现明显白化表型，结果未显示)。

注射10 d后，沉默NbJ1的植株系统叶略微卷曲，无其他明显表型；沉默NbJ5的植株出现系统叶卷曲、植株矮小的症状(图3-A)。

选用特异性引物TRV-detect对实验组和对照组植株做PCR检测，各组植株中均可扩增到与对应载体上一致的目的基因序列，表明植株均被TRV成功侵染(图3-B)。利用qPCR检测NbJ1与NbJ5基因表达量，将对照组植株检测基因表达量视为1，实验组基因表达量分别为0.33和0.17。重复3次以上试验，分析发现NbJ1与NbJ5基因表达的稳定值为30%，即沉默效率可达70%，确定系统沉默已发生(图3-C)。

2.4 沉默NbJ1和NbJ5基因不利于TuMV侵染

分别在沉默DnaJ基因的植株和对照植株上摩擦接种TuMV(毒源为注射接种TuMV-GFP侵染性克隆后发病的本氏烟系统叶)，每株植物在同等叶位接种等量病毒，持续监测病毒侵染状况。观察发现，对照组植株TuMV接种叶和系统叶的荧光出现均早于沉默NbJ1的植株，即对照组植株病毒含量更多，图4-A显示了接种病毒3.5 d时接种叶的发病情况，图4-B为接种病毒6 d时植株系统叶的情况。分别取接种叶与系统叶做Western Blot检测，结果显示对照组GFP蛋白含量更多(图4-C与图4-D)，即对照组植株病毒含量多于沉默组植株。

A，TRV介导的本氏烟NbJ1基因沉默植株与对照组植株相比，生长表型未显示明显差异；本氏烟中沉默NbJ5基因植株表现为系统叶卷曲；B，PCR检测TRV载体，结果显示对照组植株与实验组植株均被TRV成功侵染；C，qPCR检测沉默NbJ1植株、沉默NbJ5植株与对照组植株的NbJ1基因相对表达水平。A，TRV-induced NbJ1 gene silencing in N.benthamiana did not show significant differences in growth phenotypes compared with control plants; and NbJ5 silenced plants showed systematic leaf curl; B，PCR detection of TRV showed that both the control and treatment groups were successfully infected with TRV; C，qPCR detection of NbJ1 gene relative expression level in NbJ1 gene silencing plants，NbJ5 gene relative expression level in NbJ5 gene silencing plants and control plants.图3 TRV介导的本氏烟NbJ1和NbJ5基因的沉默Fig.3 Effects of TRV-induced NbJ1 and NbJ5 silencing in N.benthamiana plants

沉默NbJ5的植株与沉默NbJ1的植株在接种TuMV后显示了相同的症状，表明沉默DnaJ基因的植株中病毒侵染受到了抑制(图5)。

3 讨论

DnaJ蛋白普遍存在于生物界，在生物体内调节多种生理活动并参与多种病毒的侵染。DnaJ蛋白家族根据结构不同划分为3类亚家族，本研究在本氏烟中克隆得到了分属DnaJ蛋白A类和B类亚家族的16条基因序列，并命名为NbJ1～NbJ14，NbJ12-2和NbJ14-2。C类亚家族蛋白C端序列高度变异，本研究未对该类基因进行深入分析。分别对A、B两类亚家族蛋白的典型代表NbJ5与NbJ1与来自细菌、真菌、植物与动物等不同物种的亚家族蛋白做同源性分析，结果显示NbJ5与植物来源的同家族DnaJ蛋白亲缘关系较真菌及动物来源的蛋白更远，这类蛋白在生物进化中可能更为保守；NbJ1则与植物来源的同家族DnaJ蛋白同源性较高，与真菌、动物和细菌来源的蛋白亲缘关系较远。

NbJ1与NbJ5分别为DnaJ蛋白B类与A类亚家族典型代表，且均与参与植物病毒侵染的寄主DnaJ蛋白具有高度相似性。与NbJ1蛋白序列具有很较高相似性的DnaJ蛋白PSL1IP2与PVX的CP和复制与运动相关的茎环结构SL1相互作用，过表达或缺失该基因均可抑制病毒侵染[18]；普通烟草与该蛋白序列高度相似的蛋白NtDnaJ-M541则与TSWV的运动蛋白NSm相互作用[16]。NbJ5蛋白序列与NCBI数据库中的MIP1.3蛋白完全相同，该蛋白在本氏烟中协助TMV侵染，且至少有2个与TMV的运动蛋白相互作用的区域[14]。另外，大肠埃希菌DnaJ蛋白参与BMV负义链RNA合成；普通烟中的DnaJ-like蛋白NtCPIP与PVY的外壳蛋白相互作用，可能参与了病毒的运动过程[17]。在水稻中筛选得到与RSV的运动蛋白PC4相互作用的DnaJ类蛋白[15]。本研究发现，这2个基因的沉默均不利于TuMV的侵染，说明这2个基因在TuMV侵染过程中也发挥了作用。DnaJ-like蛋白在其他病毒上的作用皆通过与病毒蛋白互作、参与病毒的复制或运动，因此，推测DnaJ-like蛋白可能也是通过与TuMV蛋白互作的方式来实现功能，后续有必要对此开展深入研究。

A，接种TuMV 3.5 d，沉默NbJ1植株与对照组植株接种叶相比，荧光斑点数量明显减少；B，接种TuMV 6 d，沉默NbJ1植株与对照组植株系统叶相比，荧光亮度明显减弱；C，Western blot检测接种叶TuMV含量，结果显示，沉默NbJ1植株接种叶病毒蛋白含量明显少于对照组植株；D，Western blot检测系统叶TuMV含量，结果显示沉默NbJ1植株系统叶病毒蛋白含量明显少于对照组植株。A，The fluorescent spots number was significantly reduced on inoculated leaves in treatment plants compared with the control plants at 3.5 d; B，The fluorescence intensity was significantly reduced on systemic leaves in treatment plants compared with the control plants at 6 d; C, Western blot analysis of inoculated leaves TuMV infected showed that the virus protein content in TRV∶NbJ1 plants was significantly less than that in the control plants; D，Western blot analysis of systemic leaves TuMV infected showed that the virus protein content in TRV∶NbJ1 plants was significantly less than that in the control plants.图4 NbJ1系统沉默对TuMV侵染的影响Fig.4 Effect of NbJ1 silencing on TuMV infection

A，接种TuMV 3.5 d，沉默NbJ5植株与对照组植株接种叶相比，荧光斑点数量明显减少；B，接种TuMV 6 d，沉默NbJ5植株与对照组植株系统叶相比，荧光亮度明显减弱；C，Western blot检测接种叶TuMV含量，结果显示沉默NbJ5植株接种叶病毒蛋白含量明显少于对照组植株；D，Western blot检测系统叶TuMV含量，结果显示沉默NbJ5植株系统叶病毒蛋白含量明显少于对照组植株。A，The fluorescent spots number was significantly reduced on inoculated leaves in treatment plants compared with the control plants at 3.5 d; B, The fluorescence intensity was significantly reduced on systemic leaves in treatment plants compared with the control plants at 6 d; C，Western blot analysis of inoculated leaves TuMV infected showed that the virus protein content in TRV∶NbJ5 plants was significantly less than that in the control plants; D，Western blot analysis of systemic leaves TuMV infected showed that the virus protein content in TRV∶NbJ5 plants was significantly less than that in the control plants.图5 NbJ5系统沉默对TuMV侵染的影响Fig.5 Effect of NbJ5 silencing on TuMV infection