无患子提取物对痤疮丙酸杆菌的抑制作用及其应用研究

2018-12-28魏敏平郭亚辉谢云飞成玉梁姚卫蓉

中国洗涤用品工业 2018年12期

魏敏平于航郭亚辉谢云飞成玉梁钱和姚卫蓉

（江南大学食品学院，江苏无锡，214122）

痤疮（Acne），俗称青春痘、粉刺等，是一种慢性炎症性皮肤病。大量学者认为，痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes，以下简称P. acnes）的侵入是导致痤疮发病的一个重要因素[1]。目前，痤疮主要是通过内、外服用抗生素来进行治疗。使用西药对人体具有一定的副作用，并且由于抗生素的滥用，导致致病菌产生耐药性，使得治疗痤疮的疗效不显著。因此，国内外学者便致力于从植物中提取高效、低毒的活性成分来探究它们对痤疮相关病原菌的抑制作用。研究表明，具有抑制痤疮致病菌的植物活性成分种类繁多，包括黄芪甙[2]、石竹烯[3]、茶多酚[4]、甾体皂苷[5]以及芦荟素[6]等。

无患子（Sapindus mukorossi），属于无患子科，俗称为木患子[7]、洗手果等，是一种中型落叶树，高12～20米，树皮平滑不裂，颜色为灰白色[8]。无患子果皮中富含三萜类皂苷，该物质具有优良的表面活性，以及杀菌、消炎、抗氧化、抗肿瘤等药理功效，其中无患子皂苷的抑菌作用具有广谱性。研究报道称，无患子果皮的乙醇提取物对埃希氏大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）的抑制作用比其水提物对两种菌的抑制效果较好，且不会产生耐药性[9]。此外，黄彦勋[10]曾开展无患子果皮乙醇提取物对P. acnes、E. coli及S. aureus的体外抑菌活性研究，实验得出供试样品对三种细菌的抑制效果相似，MIC分别为40、50、50mg/mL，表明无患子果皮中含有对皮肤致病菌具有抑制作用的有效成分。

目前基于无患子所开发的产品较多，包括洗发水、沐浴露等，但并未见将其应用在面膜中的报道。虽已有文献报道无患子提取物可抑制P. acnes的生长，但抑制效果不理想。鉴于此，本实验以无患子果皮为原料，采取水提发酵结合乙酸乙酯萃取工艺提取活性成分，利用体外抑菌实验对其抑制P.acnesATCC 6919活性进行了研究。然后基于无患子发酵浓缩液，研究其不同添加量对面膜的pH、黏度及抑菌性的影响，结合感官评价对适宜添加量进行确定，以期拓展无患子的开发利用领域。

1 实验

1.1 实验材料

无患子干果皮：由福建省源华林业生物有限公司提供；无患子总皂苷标准品：江南大学食品学院食品安全与质量控制研究中心自制。痤疮丙酸杆菌ATCC 6919（Propionibacterium acnesATCC 6919，以下简称P. acnesATCC 6919）：广东省微生物菌种保藏中心提供；米曲霉：江南大学食品学院食品安全与质量控制研究中心保藏。生化级：胰蛋白胨、酵母浸膏、琼脂等；日化级：羧甲基纤维素、海藻酸、聚乙二醇1000等，以上试剂均购自于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验仪器

TU-1900紫外可见分光光度计：岛津公司；R-1002型旋转蒸发仪：上海申科生物科技有限公司；THZ-82恒温振荡器：国华企业；PYX-DHS-50×65-BS隔水式电热恒温培养箱：上海跃进医疗机械厂；LS-B 50 L型杀菌锅：上海医用核子仪器厂；DELTA320型pH计：梅特勒-托利多仪器有限公司；氧气罐、5804R冷冻离心机：德国Eppendorf公司；AG0025A厌氧罐：英国oxoid公司；NDJ-1黏度计：上海平轩科学仪器有限公司。

1.3 无患子果皮活性成分的提取

1.3.1 样品的准备

将无患子干果皮与水按照料液比1∶2的比例进行混匀，参考伍恒[11]的研究，采取溶剂浸渍法提取皂苷，得到无患子皂苷粗滤液。将粗滤液以4500r/min离心15min，然后于升膜蒸发设备中浓缩6～7倍，得到无患子水提浓缩液，按1.5%的接种量将米曲霉活化液（1/2水提浓缩液的稀释液）接种于水提浓缩液中，于30℃静置培养5天，然后离心、浓缩，得到无患子水提发酵浓缩液（SFW），另取一定量SFW用乙酸乙酯按1∶3的比例混匀，以50次/min在常温下萃取2次，每次6min。静置分层，合并3次有机相，然后于升膜蒸发设备中浓缩，得到无患子乙酸乙酯萃取液（EAWF）。

1.3.2 皂苷含量的测定

标准曲线的制作按参考文献[11]进行。

样品的测定：将无患子皂苷提取液稀释适当倍数，取100mL稀释液于20mL比色管中，其余操作流程与标准曲线相同，样品重复测定3次。

固形物含量借鉴参考文献[12]的方法进行。皂苷含量、得率及纯度按下式进行计算：

无患子皂苷含量（mg）= 皂苷浓度×稀释倍数×提取液总体积

1.4 无患子提取物对痤疮丙酸杆菌抑制活性的测定

将适量EAWF用蒸馏水配制成皂苷浓度为50mg/mL的样品溶液，备用。

1.4.1 MIC的测定

取P. acnesATCC 6919接种于厌氧琼脂平板，将活化好的菌株采用麦氏比浊法用无菌生理盐水稀释成含菌量约为106的悬浮液，待用。MIC的测定参照文献[13]进行，以生理盐水做阴性对照，红霉素做阳性对照，样品及对照分别做3个平行实验。

1.4.2 最低杀菌浓度（MBC）的测定

将提取物稀释接近MIC，分别在900mL不同浓度的植物提取物中加入106cfu/mL的菌悬液100mL，37℃水浴保持60min；吸取各含菌提取物100mL进行涂布，然后在厌氧条件下培养48h。观察细菌生长情况，其中无菌落生长对应的浓度作为MBC。

1.4.3 抑菌率的测定

抑菌率参考文献[14]进行测定，并依据下式计算抑菌率：

1.5 无患子提取物在面膜中的应用初探

1.5.1 水洗面膜的配方与制作

通过查阅文献并结合本实验室之前的研究工作，得到水洗面膜配方，如表1所示。具体的制作工艺流程如下：

（1）于250 mL烧杯中加入适量D，水浴加热至80℃，准确称取A中各成分与D混合，不断搅拌直至充分吸水溶胀，然后搅拌降温；

（2）将一定量B与C一起加至步骤1中，保持65℃，搅拌均匀；

（3）搅拌降温至40℃，将E加至步骤2中，搅拌均匀。

表1 水洗面膜的配方

1.5.2 无患子提取物在水洗面膜中适宜添加量的确定

（1） pH

按照GB/T13531.1-2008化妆品通用检验方法[15]，对面膜样品的pH值进行测定。

（2）黏度

本试验采用NDJ-1黏度计对样品黏度进行测定。

（3）抑菌率

对面膜样品采用去离子水进行适当稀释，参照“1.4.5”的操作，测定各个面膜样品对P. acnes ATCC 6919的抑菌率。

（4）感官评定

以20人（经过相关培训的具有专业背景的8名男生和12名女生）组成评判小组，分别以水洗面膜的色泽、气味、均匀性、细腻感、延展性和滋润感为因素集，以很好、一般、较差为评语集，建立6个单因素矩阵和主因素突出型综合评判模型，采用权重分配方案和M综合评判模型进行分析。

2 结果与讨论

2.1 MIC与MBC

本实验通过二倍稀释法测定EAWF对P. acnesATCC 6919的MIC，结果如表2所示。从表中可看出P. acnesATCC 6919只在阴性和0.125、0.0625mg/mL加药试管中长出菌落，其余试管中均未长菌，由此可知，其MIC为0.25mg/mL。有研究学者采用乙醇对无患子果皮活性成分进行提取，得到乙醇提取物对痤疮丙酸杆菌的MIC为50mg/mL[10]，由此可见，本实验所得结果优于文献报道值，这可能与提取工艺条件的不同有关。本实验通过“1.4.2”方法进一步测定EAWF对P. acnesATCC 6919的MBC，结果与MIC值相同，为0.25mg/mL，从而表明EAWF对P.acnesATCC 6919具有较好的抑制活性，可为后续实验提供数据参考。

图1 EAWF浓度对痤疮丙酸杆菌ATCC 6919抑制率的影响（该菌于37℃厌氧培养48h）

表2 EAWF对痤疮丙酸杆菌ATCC 6919的MIC

2.2 抑菌率

EAWF对P. acnesATCC 6919的抑菌率结果见图1。数据表明，当EAWF浓度从0.25mg/mL增加到2.00mg/mL时，其对P. acnesATCC 6919的抑菌率具有浓度依赖性（r=0.982），说明EAWF中抑菌活性亦随提取物浓度的增加而增加。当EAWF浓度为2.00mg/mL（即8MIC）时，抑菌率为100%；随着浓度的继续增加，抑菌率仍保持不变。由此可见，EAWF抑菌活性物质的有效浓度达到一定剂量时，对P. acnesATCC 6919的抑制作用达到最佳，随着浓度的进一步增加，其抑制效果仍保持不变，从而进一步说明EAWF 对P. acnesATCC 6919具有较好的抑制作用。相比之下，阳性对照组的抑菌率随着浓度的升高虽呈上升的趋势，但在浓度低于2.00mg/mL时抑菌率未达100%，当其浓度增加到8.00mg/mL时其抑菌率为100%，从而表明改为EAWF对供试菌的抑制率优于红霉素组。

目前，基于无患子提取物开发的洗护产品主要包括洗发露、洗手液、沐浴露等，但是未见将其应用于面膜中的文献报道。基于上述研究，本研究将浓度为2.00mg/mL的SFW添加至水洗面膜基质中，进行无患子提取物在面膜产品开发的初步研究。

2.3 无患子提取物添加量对面膜特性的影响

2.3.1 添加量对面膜pH的影响

无患子提取物添加量对面膜的pH影响结果如图2所示。

从图2中可见，随着SFW添加量的增加，面膜的pH先由6.84增至6.90，然后从6.90逐渐降低至6.70，分析原因是面膜基质的pH低于SFW（pH为6.93），当加入少量的SFW时，pH在一定范围内会随着添加量的增加而升高；当添加量继续增加时，面膜配方中的其他酸性成分以及SFW的弱酸性导致样品的pH逐渐降低。但在整个添加量范围内，pH的变化较小，由此表明，SFW对本研究面膜配方的pH影响较小。此外，实验结果表明，所有面膜样品均符合QB/T2872-2017[17]的相关规定，即在25℃下，pH范围为4.0～8.5。人体正常面部皮肤pH呈弱酸性，可见本实验所研制的无患子面膜产品适于大多数人群。

图2 不同添加量的SFW对水洗面膜pH的影响

图3 不同添加量的SFW对水洗面膜黏度的影响

2.3.2 添加量对面膜黏度的影响

SFW添加量对面膜黏度的影响结果如图3所示。由图3可知，随着SFW用量的增加，黏度变化为先上升，然后逐渐下降。当SFW用量为20%时，整个体系黏度达到最大值。黏度是面膜的重要指标之一，它不仅影响面膜的延展性、稳定性，而且也会影响消费者的使用感觉。黏度适中的水洗面膜质地细腻润滑，具有较强黏弹性，易于抹开，且成膜均匀；而黏度适中的贴式面膜，精华液外观细腻，无发黏现象，挂在面膜布上不会有液滴。目前，由于没有面膜黏度的相关标准，因此无法对SWF的添加量进行判断。痤疮丙酸杆菌的定植是引起痤疮发病的主要原因之一，已有文献报道在面膜基质中添加中草药浸提物[18]，可对治疗痤疮具有较好的疗效，因此本实验进一步考察了SWF添加量对面膜抑制痤疮丙酸杆菌的影响。

2.3.3 添加量对痤疮丙酸杆菌抑制率的影响

在水洗面膜基质中加入不同量的SFW，得到的面膜样品对P. acnesATCC 6919的抑制率如图4所示。由图4可知，未加入SFW的面膜样品对供试菌基本无抑制效果，添加SFW的面膜样品对P. acnesATCC 6919均表现出抑制作用。当SFW添加量从10%增加到40%，抑菌率由10.98%增至77.32%，并且具有一定的浓度依赖性（r=0.991），分析原因这可能与SFW中抑菌成分的含量增加有关。在面膜的研发过程中，除了要考虑产品的功能特性，还应考察面膜的基本感官特性，因此，本实验后续结合人群的感官评定来对SFW适宜添加量进行判断。

图4 SFW添加量对水洗面膜抑制痤疮丙酸杆菌ATCC 6919的影响

2.4 添加SFW的面膜感官评定

本实验按表3从涂抹前、涂抹中、涂抹后3个阶段对添加SFW的水洗面膜进行了感官评定。

表3 水洗面膜感官评分标准

添加SFW的面膜感官评定结果如表4所示。添加量由0增加到40%，对7款样品进行编号，依次为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#。

以1#水洗面膜为例，可建立色泽、气味、均匀性、细腻感、延展性和滋润感6个单因素的模糊评价矩阵[18]：

A色泽= [0.80 0.10 0.10]

A气味= [0.80 0.20 0.00]

A均匀性= [0.80 0.20 0.00]

A细腻感= [0.80 0.20 0.00]

A延展性= [0.40 0.30 0.30]

A滋润感= [0.90 0.05 0.05]

将1#水洗面膜样品的单因素评价结果建成一个模糊评价关系矩阵，即：

同理可得，2#～7#水洗面膜的模糊评判关系矩阵分别如下：

然后经模糊线性转换，可得模糊综合评判矩阵为：

表4 水洗面膜中添加SFW的感官评定结果

同理：

B2=（0.8540，0.1295，0.0165）

B3=（0.9470，0.0495，0.0035）

B4=（0.8025，0.1545，0.0430）

B5=（0.7865，0.1675，0.0460）

B6=（0.7795，0.1840，0.0365）

B7=（0.6105，0.2680，0.1215）

1#水洗面膜的总分为：T1=B1×V=（0.7290，0.1695，0.1015）×（90，60，40）=82.66。

同理，得到2#～7#水洗面膜的综合评判结果分别为：T2=85.29，T3=88.34，T4=83.22，T5=82.68，T6=82.66，T7=75.89。

由综合评判结果得出，7种添加SFW的水洗面膜样品的感官品质优劣顺序为：3#〉2#〉4#〉5#〉6#= 1#〉7#。即：15% SFW-水洗面膜〉10% SFW-水洗面膜〉 20% SFW-水洗面膜〉 25% SFW-水洗面膜〉30% SFW-水洗面膜 = 水洗面膜〉40% SFW-水洗面膜。结果表明，在水洗面膜中加入15%的SFW的感官评价最高，而在水洗面膜中加入40%的SFW的感官评分最低，分析原因可能是SFW液体为棕黑色，随着其添加量的增加，面膜的色泽也逐渐加深，从而影响了评判人员对其感官品质的评定。因此，添加15% SFW的水洗面膜综合评价最高，可接受性最好。此外，模糊综合评判是建立在模糊数学基础上的一种定量评价模式，可有效地消除人为误差，本研究结果表明，模糊数学综合评判法可用于水洗面膜的感官评价，且具有较高的可信度。

应用模糊综合评判方法，消除了其他各种感官评定方法的人为随意性，使评判结果科学有效，对促进面膜工业化生产具有重要意义。