间充质干细胞来源外泌体在创面修复中的作用及其机制研究进展

何强 张培华

[摘要]外泌体是细胞分泌的直径30～100nm的脂质双层膜囊泡。间充质干细胞的许多功能可通过其旁分泌的外泌体发挥作用。研究表明，间充质干细胞来源外泌体能通过有效转运母细胞来源的特异性蛋白质、mRNA、microRNA、脂质等生物活性物质进入靶细胞，调控创面愈合过程中炎症反应、细胞增殖、迁移、分化、血管生成与基质重建等多个阶段，促进创面愈合与抑制瘢痕形成，提升创面修复能力，具有良好的临床应用前景。本文就间充质干细胞来源外泌体在创面修复中作用及机制进行综述。

[关键词]外泌体；间充质干细胞；创面修复；促进愈合；抑制瘢痕

[中图分类号]R641 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）09-0143-06

Progress of Exosomes Derived from Mesenchymal Stem Cells

in Repair of Cutaneous Wound in Relation to Function and Mechanism

HE Qiang， ZHANG Pei-hua

（Department of Plastic Surgery，Guangdong Medical University， Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Zhanjiang 524000，Guangdong，China）

Abstract： Exosomes are lipid membrane-enclosed vesicles whose diameter is 30-100 nm secreted by various cell types， and mesenchymal stem cells （MSCs） function via the paracrine pathway--exosomes. Recently， several studies have demonstrated that exosomes derived from MSCs can effectively carry bioactive substance into recipient cells， such as specific proteins， mRNAs， microRNAs and lipids derived from the parental cells. These mocular cargoes can regulate many biological processes in the repair of cutaneous wound， such as the inflammatory response， cell proliferation， cell migration， cell differentiation， blood vessel tube formation and matrix reconstruction， which not only promote wound healing but also inhibit the development of scar to enhance the capacity for wound repair. Therefore， exosomes derived from MSCs have a good clinical application prospect. This review will discuss the current literature regarding the role of exosomes derived from MSCs in cutaneous wound repair， especially the function and mechanism.

Key words： exosomes； mesenchymal stem cells； cutaneous wound repair； improvement of healing； inhibition of scar

外泌體（Exo，exosomes）是一种经细胞内体途径生成并释放到细胞外的囊性小泡，直径介于30～100nm，由磷脂双层膜包被，其内包裹脂质、蛋白质、核酸等多种生物活性物质，电镜下观察呈杯状，是参与细胞间物质转运与信息传递的重要角色[1]。1983年，Pan等在观察绵羊网织红细胞成熟过程中首次发现包裹代谢终产物并释放到细胞外的小囊泡，1987年Johnstone等将其正式命名为“外泌体”[2-3]。此后发现，包括间充质干细胞（MSCs，mesenchymal stem cells）在内的几乎所有细胞都能分泌外泌体，并释放入细胞外环境中，如细胞培养上清液，以及各种体液，包括血液、淋巴液、脑脊液、唾液、尿液、羊水等[4]。

新近研究表明，外泌体在细胞间信号通讯中发挥重要作用，具有免疫调节、促进血管再生、以及介导细胞增殖、分化、迁移、凋亡等功能，维持机体的正常生理状态与参与疾病进程[5]。其中间充质干细胞来源外泌体具有来源细胞特性，能促进受损区域细胞自我修复与组织再生，恢复组织内稳态，加速创面修复[6]。本文即对近年来间充质干细胞来源外泌体在创面修复中作用及其机制的研究新进展综述如下。

1 外泌体的构成

外泌体是经由内体途径形成的。首先，细胞质膜多处凹陷，向内出芽形成初级核内体，母细胞释放颗粒物质进入初级核内体中并继续凹陷出芽形成含有多个管腔状囊泡的多囊泡体（MVB，multivesicular body）。其次，MVB与胞膜融合，其内的管腔状囊泡再次凹陷出芽形成颗粒状小囊泡，并释放到胞外，这些释放到胞外的颗粒状小囊泡即为外泌体[1]。

相关研究表明，外泌体富含多种生物活性物质，包括脂质、蛋白质、核酸等：①脂质构成了外泌体的膜结构，主要成分有神经酰胺、磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂和胆固醇，为外泌体提供了结构稳定性；②蛋白质是发挥外泌体功能的重要载体，其主要分为两类：一类是与来源细胞类型有关的特异性蛋白，它们决定了不同来源细胞功能上的差异；另一类与来源细胞类型无关，是大多数细胞所共有的蛋白，主要来源于细胞的核内体、质膜、胞质液，包括四跨膜蛋白超家族（CD63、CD81、CD9）等黏附蛋白，细胞信号分子，内吞体分拣转运复合物（ESCRT），膜联蛋白、Rab、flotillin等介导膜融合相关蛋白，主要组织相容性复合体（MHC）等表面抗原，细胞骨架蛋白，代谢酶，热休克蛋白70（HSP70），Alix，肿瘤易感基因101（TSG101），以及其他胞浆蛋白、跨膜蛋白。其中膜联蛋白和flotillin 有助外泌体的运输与融合，四跨膜蛋白超家族参与细胞靶向作用，Alix和TSG101參与了MVB的形成过程等；③核酸是外泌体的主要信息传递物质，包括DNA、mRNA、microRNA、lncRNA、circRNA等，参与细胞间的通讯与调控受体细胞功能[7]。

外泌体在蛋白质、mRNA、miRNA的分子多样性，使外泌体具有向受体细胞提供多种不同的调节方式，如蛋白质在外泌体释放时直接发挥生物效应、mRNA翻译为更高水平的蛋白质、miRNA调节蛋白质的翻译与受体细胞内mRNA的种类等，提升了外泌体对受体细胞的作用能力[8]。

2 间充质干细胞来源外泌体在创面修复中的作用

慢性创面及瘢痕疙瘩是创面修复领域的两大难题，而慢性创面主要包括烧伤、外伤后残余创面、糖尿病皮肤溃疡、静脉性溃疡、褥疮、放射性损伤等。目前，针对慢性创面的治疗主要为皮瓣移植、生长因子疗法、负压辅助封闭疗法、高压氧疗法、电磁疗法、干细胞与组织工程疗法等，但皮瓣移植治疗过程痛苦、疗程长，生长因子疗法作用靶点单一，而其他辅助疗法也仅通过维持创面处于稳定状态，而不能通过主动激活伤口愈合机制从而促进创面修复。此外，针对瘢痕疙瘩主要采用手术、瘢痕内注射、激光、冷冻疗法等综合治疗，手术疗法很难根除瘢痕疙瘩，瘢痕内注射、激光、冷冻疗法等常常不能达到预期效果。干细胞与组织工程疗法作为创面修复的新技术，备受期待，但干细胞的应用同样存在伦理舆论、致畸致瘤、免疫排斥、移植率低、存活率低等诸多风险。

MSCs具有自我更新及分化能力，能促进组织修复与再生[9]。有研究表明，外泌体是细胞间的重要信号载体，其特性与其来源细胞密切相关。因此，间充质干细胞来源外泌体（MSCs-Exo）作为其亲代细胞的旁分泌途径载体，如骨髓间充质干细胞来源外泌体（BMSCs-Exo，exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cells）、脐带间充质干细胞来源外泌体（uMSCs-Exo，exosomes derived from umbilical cord mesenchymal stem cells）、脂肪间充质干细胞来源外泌体（ADSCs-Exo，exosomes derived from adipose mesenchymal stem cells）等，在治疗慢性创面方面取得了一定进展，有望通过标准化、规模化的组织工程开展进一步的临床治疗研究。

大量动物实验表明，MSCs-Exo能显著促进创面愈合。在深Ⅱ度烧伤大鼠模型中，uMSC-Exo能促进表皮、真皮细胞再生及血管新生，从而加速创面愈合[10-11]。在深度外伤创面大鼠模型中，诱导多能MSCs-Exo能提升创面闭合率，提升再上皮能力，减少瘢痕宽度，增加胶原蛋白的成熟度，促进皮脂腺与毛囊形成，新生血管与成熟血管密度均上升[12]。在糖尿病大鼠模型中，牙龈干细胞来源外泌体（GMSCs-Exo，exosomes derived from gingival mesenchymal stem cells）与多孔的壳聚糖/丝素凝胶海绵联合应用，能促进创面区再上皮化，促进胞外基质的产生，以及促进创面血管的新生[13]。也有文献表明，ADSCs-Exo能降低辐射损伤[14]，使被辐射的隐窝再生，改善小鼠肠内器官功能及显著提升生存率，进一步研究可验证MSCs-Exo对皮肤创面的治疗效用。

此外，在一定条件下，外泌体功能会得到一定程度的调控。在深Ⅱ度烧伤大鼠模型中，3，3'-二吲哚甲烷处理后的uMSC-Exo比未处理的uMSC-Exo能进一步促进创面愈合[15]。有研究人员将miR-126-3p过表达滑膜间充质干细胞来源外泌体包入羟基磷灰石/壳聚糖复合水凝胶中，使外泌体具有受控释放的特性，促进伤口表面的再上皮化，加速血管生成，以及加速胶原蛋白的成熟[16]。但是，一定条件下外泌体功能也会受损，如肥胖会损伤外泌体的促血管生成能力[17]。

3 间充质干细胞来源外泌体在瘢痕治疗中的作用

MSCs-Exo除了能加速创面愈合，还能从三方面抑制瘢痕形成。一方面，GMSC-Exos能抑制炎症反应，其外泌体源IL-1RA起关键性作用，IL-1RA敲除后小鼠创面愈合时间延迟，而将重组IL-1RA阿那白滞素注射进敲除小鼠可缩短愈合时间，且GMSC-Exos注射到创面能预防瘢痕形成[18]。另一方面，uMSC-Exo能通过抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，预防创面瘢痕形成[19]。此外，在深度外伤创面小鼠模型中，ADSCs-Exo能减少胶原蛋白沉积[20]，或提升Ⅲ型/I型胶原蛋白比值，从而减少瘢痕形成[11]。瘢痕形成是一个顽固的病理进程，很难逆转，MSC-Exo为解决瘢痕形成问题提供了新的解决途径。

4 间充质干细胞来源外泌体在创面修复中作用机制的研究进展

皮肤创面修复是肉芽组织、皮肤及其周围组织再生，甚至瘢痕组织形成的复杂机体修复过程，经历止血期、炎症反应期、细胞增殖期、基质重塑期等四个阶段。它需要上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞等多种细胞的协同作用，包括细胞的增殖、迁移和基质合成，以及各种生长因子相关信号的传递。创面修复出现异常时，将可能向慢性创面及瘢痕疙瘩两个病理进程发展，成为创面修复研究的难题[21-22]。MSCs-Exo通过向靶细胞转运特异性蛋白、脂质、mRNA、microRNA等信号分子，调控创面愈合过程中炎症反应、细胞增殖、迁移、血管生成与基质重建等多个阶段，从而促进创面愈合，抑制瘢痕形成[23-24]。

4.1 调控炎症反应：炎症是协调创面修复的重要阶段。粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等炎症细胞以及肿瘤坏死因子-α（TNF-α，tumor necrosis factor-α）、白细胞介素-1β（IL-1β，interleukin-1β）等炎症因子协同参与炎症反应，对抗感染及清除细胞碎片。适度炎症有利伤口愈合，过度炎症可能导致多器官衰竭甚至死亡。MSCs-Exo能调控炎症反应，保护受损组织，降低炎症毒性伤害并提升组织耐受性[25]，尤其外泌体中富含miRNA，在调控炎症过程中起着重要作用。

研究表明，uMSCs-Exo能抑制炎症反应，达到加速创面愈合与预防疤痕双重作用。其内源性miR-181c能抑制TLR4信号通路，减弱脂多糖介导的炎症反应，使中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞数量减少，TNF-α、IL-1β等炎症因子表达下降，IL-10抗炎症因子表达升高[26]。而BMSCs-Exo能调控炎症反应，其包裹的miR-155能促进内毒素诱导的炎症反应，而miR-146a則抑制内毒素，两者协同调控炎症基因的表达[27]。最新研究表明，Fas能够与Fas相关磷酸酶-1（Fap-1）和小窝蛋白-1（Cav-1）相结合，激活可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子（NSF）相关附着蛋白受体（SNARE）介导的膜融合机制，即Fas / Fap-1 / Cav-1复合体激活SNARE，从而刺激GMSCs-Exo的释放。同时，GMSCs-Exo能通过Fas/Fap-1/Cav-1级联反应对白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1RA，IL-1 receptor antagonist）进行表达，而TNF-α能够作为激活剂通过NF-κB途径上调Fas和Fap-1表达以促进IL-1RA释放，抑制炎症反应，促进创面愈合[18]。

4.2 细胞增殖与迁移：细胞的增殖与迁移构成了创面修复的基础。伤口愈合不仅需要多种生长因子、细胞因子调控各类创面细胞的细胞周期，也需要上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞等迁移到伤口部位执行特定功能，如成纤维细胞填补组织缺损与合成细胞外基质、内皮细胞促进血管生成、上皮细胞逐渐覆盖创面等[28]。MSCs-Exo能被受体细胞内化并将其内容物转运进入细胞，如蛋白质、RNA等，实现对受体细胞增殖、迁移的调控。

已有研究证明，MSCs-Exo能通过调节生长因子及相关基因表达，调控成纤维细胞的增殖与迁移[20，29-30]，从而参与肉芽组织的形成，以及合成为伤口修复提供结构的胶原蛋白[21，31]。其中，BMSCs-Exo能激活AKT、STAT3和ERK1/2信号通路，诱导成纤维细胞增殖与迁移，具体机制可能与信号通路激活后，使肝细胞生长因子（HGF，hepatocyte growth factor）、白细胞介素-6（IL-6）、胰岛素样生长因子1（IGF1，insulin-like growth factor）、神经生长因子（NGF，nerve growth factor）、基质细胞衍生因子1（SDF1，stromal cel derived factor-1）等多种生长因子表达上调有关[17]。CD63+的BMSCs-Exo能增强摄取外源性Wnt3a的能力，并将其进入成纤维细胞，通过Wnt/β-catenin信号通路促进成纤维细胞的增殖与迁移。ADSCs-Exo也能通过上调神经钙黏素（N-cadherin）、细胞周期素-1（cyclin-1）、增殖细胞核抗原（PCNA，proliferative cell nuclear antigen）等增殖相关基因的表达，促进成纤维细胞增殖[20]。另一方面，Bin等认为，uMSCs-Exo在高细胞密度情况下，外泌体源的蛋白质14-3-3ζ通过诱导YAP磷酸化，激活Hippo-YAP从而反向作用Wnt/β-catenin信号通路，抑制成纤维细胞的增殖与迁移，以防组织过度增殖[10]。而且，Wang等[11]认为，ADSCs-Exo能通过作用于成纤维细胞，调整Ⅲ型/I型胶原蛋白比值，抑制瘢痕形成。以上研究表明，MSCs-Exo对成纤维细胞的调控功能在创面修复过程中，可以发挥促进伤口愈合与抑制瘢痕形成的双重作用。

有学者认为，uMSC-Exo也能促进人永生化表皮细胞（HaCaT）的增殖与迁移，并通过凋亡诱导因子（AIF，apoptotic induction factor）转位入核，下调多聚ADP聚合酶-1（PARP-1）和聚ADP核糖（PAR）的表达，抑制Caspase非依赖的线粒体凋亡信号通路，进而抑制HaCaT的凋亡，促进皮肤创面的修复[32]。同时，MSCs-Exo也能通过激活信号通路，调节生长因子、细胞因子表达水平，对内皮细胞的增殖与迁移同样具有促进作用。

4.3 血管生成：新的血管形成是伤口愈合的关键。血管新生需要内皮细胞的增殖，内皮细胞之间的相互作用，血管生成因子，如血管内皮细胞生长因子（VEGF，vascular endothelial growth factor）和成纤维细胞生长因子（FGF，fibroblast growth factor）等，以及其周围细胞外基质（ECM，extracellular matrix）蛋白的共同参与。在趋化作用下，内皮细胞穿透底层血管基底膜，侵袭ECM基质，形成管状结构，并继续扩展、形成分支和创建网络的结构[33-34]。MSCs-Exo通过直接作用于内皮细胞，或上调血管生成相关的生长因子、细胞因子、趋化因子等的表达水平，间接作用于内皮细胞，从而提升内皮细胞增殖并迁移到伤口区域的能力，有助于促进血管形成，为新生组织提供营养和氧气。

有研究者认为，uMSCs-Exo能转运信号蛋白Wnt4进入内皮细胞，激活Wnt/β-catenin信号通路，介导PCNA、N-cadherin、细胞周期素D3（cyclin D3）等表达水平上调与上皮细胞钙黏蛋白（E- cadherin）表达水平下调，促进内皮细胞增殖、迁移，并形成毛细血管状管腔[35-38]。此外，uMSC-Exo能通过转运miR-30家族，如miR-30b、miR-30c、miR-424、miR-let-7f等促血管形成的microRNA，抑制Notch信号家族中血管生成抑制剂DLL4，动员内皮细胞进入基质并使血量增加，从而促进血管萌发及扩张[39]。同时，BMSC-Exo能激活AKT、STAT3和ERK1/2等创面愈合过程中重要的几个信号通路及血管形成相关的NF-κB信号通路，诱导HGF、IGF1、NGF、SDF1，以及血小板衍生生长因子（PDGF，platelet derivative growth factor），表皮生长因子（EGF，epidermal growth factor），FGF等多种生长因子表达上调[29，40]。这些作用能促进血管平滑肌、内皮细胞增殖和迁移，调节血管重塑和动脉内皮细胞的转归等，参与促血管再生过程[10，41-42]。

ADSCs-Exo也能通过转运多种microRNA （miR-31、miR-125a）与蛋白质进入内皮细胞，促进内皮细胞参与血管生成。miR-31能促进内皮细胞与内皮祖细胞的增殖、迁移并通过抑制FIH诱导血管生成。miR-125a能抑制血管生成抑制剂DDL4的表达，促进内皮顶端细胞的形成从而调节血管形成[43]。外泌体的释放也会受其他因素的影响，Lopatina等认为，PDGF能促进ADSCs-Exo 生成[44]，而Togliatto 等认为肥胖会使ADSCs-Exo中miR-126含量下降，降低其促进血管生成的能力[17，45]。除了外泌体对内皮细胞具有调控作用外，Liu等发现脂肪间充质干细胞来源细胞外囊泡能通过调节血管平滑肌细胞的增殖与迁移、巨噬细胞迁移、炎症因子表达水平及相关信号通路，抑制血管内膜新生[46]。

4.4 细胞分化：细胞分化是基因在特定条件下选择性表达的结果。一方面干细胞持续分化产生新的细胞，以替代衰老、死亡的细胞；另一方面当皮肤组织受损时会刺激干细胞分化，为创面修复提供所需的多种类型细胞，如间充质干细胞成脂分化形成脂肪组织、成内皮分化形成血管、成上皮分化形成表皮，成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，基底细胞向表皮细胞分化等，从而促进伤口愈合。

ADSCs-Exo富含大量具有调节MSC分化能力的miRNA，如miR-378、miR-222等，可能作用于靶基因STK17B和TET2，调节MSC的增殖以及调控RICTOR蛋白。而RICTOR是mTOR黏蛋白复合物-2的衔接蛋白，能调节MSC的分化，在缺氧条件下维持MSC生存及促进成血管能力，或调节细胞周期蛋白的表达、内皮细胞的功能及促进其增殖与成血管，修复受损MSC的血管新生能力[47]。而在脂肪组织来源外泌体中，其富含多种成脂miRNA，其中miR-450a-5p能通过抑制WISP2表达水平，进而调控ZNF423复合物与PPARγ-2转录激活因子的合成，以及Wnt信号通路，调节BMP4依赖性的成脂分化过程，促进脂肪干细胞的成脂分化[48-49]。虽然，成纤维细胞是参与伤口修复的主要细胞，但是肌成纤维细胞聚集会导致过度的瘢痕形成。有研究表明，uMSC-Exo富含miR-21、miR-23a、miR-125b、miR-145等microRNA，通过抑制TGF β2/SMAD2信号通路，抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，从而在伤口愈合过程中预防瘢痕形成[19]。维持MSCs的干细胞特性，即细胞的高增殖、低分化和自我更新能力，对创面修复也很重要，有研究表明，3，3'-二吲哚甲烷能刺激uMSC-Exo中Wnt11自分泌信号通路，上调GM-CSF、IL-6、MCP-2和VEGF的表达水平，增强MSCs的干细胞特性[15]。

4.5 细胞外基质重建：细胞外基质（ECM）主要包括胶原蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、层蛋白、弹性蛋白、透明质酸和糖蛋白等，其重构关键是胶原蛋白的合成与降解。ECM形成不足或过度形成会导致创面不愈合或瘢痕形成，MSCs-Exo除了參与上述细胞效应外，也被证明可以调节ECM。

最近研究表明，uMSC-Exo能促进I型胶原蛋白及弹性蛋白的合成[30]，诱导多能MSCs-Exo能促进I型、Ⅲ型胶原蛋白及弹性蛋白的合成[12]，表明MSCs-Exo能增加ECM的形成，促进创面愈合。同时，ADSCs-Exo通过阻止成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，提高胶原蛋白Ⅲ/胶原蛋白I、TGFβ3/TGFβ1、MMP3/TIMP1的比值，从而抑制瘢痕形成[11]。此外，ADSCs-Exo还能通过在伤口愈合的不同阶段调节胶原的合成，在伤口愈合早期阶段通过增加I型和Ⅲ型胶原的产量促进创面的愈合，而在晚期可以抑制胶原的合成从而减少瘢痕的形成[18]。以上研究提示外泌体在创伤愈合的ECM重构阶段起关键作用。

5 展望

生长因子疗法、负压辅助封闭疗法等创面修复的传统方法，虽然能取得一定疗效，但存在调控机制单一或只改善创面愈合环境而未主动参与创面修复机制等不足。间充质干细胞来源外泌体在保留干细胞疗效的同时还能避免干细胞应用中免疫排斥、致瘤致畸、伦理舆论等问题，并具有可长期储存的高稳定性、可定量使用的精确性、可向损伤区富集的高效性与可监测并判断愈后的可控性等优势，还有研究表明外泌体可作为药物载体特异性作用于受体细胞，在分子、基因水平提供新的治疗手段。

间充质干细胞来源外泌体富含多种蛋白质和RNA，能通过参与创面炎症反应，促进细胞增殖、迁移及分化，加速血管形成与ECM重建，发挥促进创面愈合与抑制瘢痕形成的双重功效，具有良好的再生修复潜能，但仍有诸多问题阻碍其临床应用。一方面是对外泌体自身的研究。外泌体内容物受细胞类型和所处环境影响，相关信号通路错综复杂，其物质转运与信息传递的机制尚未完全明确。另一方面是对外泌体临床应用的深化。外泌体的分离在过去由于设备要求高、操作流程复杂，而不具备大量制备与提纯的技术。但近年取得突破，Waston等研发出一套cGMP级别的方法用于外泌体的大规模生产、浓缩和分离，主要依靠生物反应器培养，再使用差速离心纯化、分子排阻色谱法与切向流过滤，批量生产外泌体，且不会显著改变颗粒产量或尺寸、形态和密度的变化[50]。然而其给药途径、最佳作用浓度与剂量、药效半衰期等临床应用问题还需进一步探索。

相信随着对外泌体发挥生物效应机制的深入研究，以及外泌体制备与纯化技术的不断革新，在控制安全性的同时提升外泌体治疗效率，未来将在再生修复领域取得瞩目的疗效。

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[收稿日期]2018-03-12 [修回日期]2018-06-28

編辑/李阳利