CYLD蛋白在皮肤附属器肿瘤中的表达和比较研究

应朝霞 肖生祥 王永贤 周俊 任建文 黄莺 宋刘梅 樊文昕 刘艳

[摘要]目的：研究CYLD蛋白在毛发上皮瘤、毛母细胞瘤和汗管瘤等皮肤附属器肿瘤中的分布、表达特征，探索皮肤附属器肿瘤的发病机理。方法：收集毛发上皮瘤、毛母细胞瘤和汗管瘤患者皮损，进行CYLD蛋白免疫组织化学染色，并通过IPP软件测定平均光密度值进行半定量分析。结果：毛发上皮瘤组、毛母细胞瘤组的平均光密度值均低于正常人毛囊对照组（P<0.001），但毛发上皮瘤组和毛母细胞瘤组CYLD蛋白平均光密度值比较，差异无统计学意义（P>0.05）。汗管瘤组的平均光密度值低于正常人汗腺对照组（P<0.001）。结论：CYLD蛋白表达于正常角质形成细胞（基底层和颗粒层为主）、毛囊、汗腺和皮脂腺的细胞质和细胞核周围区域；毛发上皮瘤、毛母细胞瘤、汗管瘤的肿瘤组织中CYLD蛋白表达水平均显著下降，提示这三种皮肤附属器肿瘤的致病机理可能与CYLD蛋白表达下调有关。

[关键词]CYLD蛋白；毛发上皮瘤；毛母细胞瘤；汗管瘤；光密度值

[中图分类号]R739.5 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）09-0114-04

Comparison on Expression of CYLD Protein in Trichoepithelioma，

Trichoblastoma， Syringoma

YING Zhao-xia，XIAO Sheng-xiang，WANG Yong-xian，ZHOU Jun，REN Jian-wen，HUANG Ying，SONG Liu-mei，FAN Wen-xin，LIU Yan

（Department of Dermatology，the Second Hospital，Xian Jiaotong University，Xian 710004，Shaanxi，China）

Abstract： Objective To further define the distribution and expression characteristics of the CYLD protein in normal skin and adnexal tumor of skin，to explore the pathogenesis of adnexal tumors of skin. Methods The expression of CYLD protein in trichoepithelioma， trichoblastoma， syringoma and normal skin was detected by immunohistochemistry. IPP softwares were applied to measure mean optical density value for semiquantitative analysis. Results The mean optical density value of CYLD protein in the trichoepithelioma group and the trichoblastoma group was lower than those of the normal hair follicle group， the differences were statistically significant（P<0.001）. However， there was no significant difference in the mean optical density value of CYLD protein between the trichoepithelioma group and the trichoblastoma group（P>0.05）. The mean optical density value of CYLD protein in the syringoma group was lower than that in the normal sweat glands group（P<0.001）. Conclusion This study suggested that CYLD protein was expressed in cytoplasm and the surrounding area of nuclei of normal keratinocyte （mainly in base layer and granular layer）， hair follicles， sweat glands and sebaceous glands. To compared with normal hair follicles and sweat glands， in the tumor tissue， as trichoepithelioma、trichoablastoma and syringoma， CYLD protein expressions were significantly decreased， suggesting that the pathogenesis of the three skin adnexal tumors may be related to the down regulation of CYLD protein expression.

Key words： CYLD protein； trichoepithelioma； trichoblastoma； syringoma； optical density value

腫瘤抑制因子头帕肿瘤综合征蛋白（Cylindromatosis，CYLD）是一种去泛素化酶，突变后会引起CYLD蛋白功能缺失，进而影响顶泌汗腺和外分泌腺干细胞的正常分化，可能会导致皮肤附属器细胞生长失衡而诱发各种肿瘤发生[1]。目前研究发现，去泛素化酶CYLD突变可导致多发性家族性毛发上皮瘤（Multiple familial trichoepithelioma，MFT）、家族性圆柱瘤（Familial cylindroma，FC）及Brooke-Spiegler综合征（BSS），呈常染色体显性遗传，但临床及病理表现不同，这些肿瘤可能是同一单基因病的表型变异[2]。CYLD基因型与临床表型之间的关系、CYLD蛋白功能缺陷引起的病理改变及CYLD突变导致肿瘤发生的机制仍需更深入的研究。毛发上皮瘤和毛母细胞瘤均属于较少见的毛源性良性皮肤附属器肿瘤，而汗管瘤为发病率较高的表皮内小汗腺导管的一种腺瘤，发病原因均不明确，临床缺少可靠治疗手段。因此，为了解CYLD蛋白在毛囊和汗腺为主的皮肤附属器肿瘤中的发病机制，本实验中分析了毛发上皮瘤、毛母细胞瘤和汗管瘤这三种皮肤附属器肿瘤中CYLD蛋白的表达特征，试图探索CYLD蛋白对皮肤附属器肿瘤的影响和作用，揭示皮肤附属器肿瘤的致病机理。

1 对象和方法

1.1 研究对象：本研究中病例均来源于笔者医院门诊，采用的病变组织均经临床和常规HE组织病理检查明确诊断的肿瘤病变组织，包括毛发上皮瘤（含非家族散发型及多发性家族型两种类型）（Trichoepithelioma，TE）10例、毛母细胞瘤（Trichoablastoma，TB）5例、汗管瘤（Syringoma）10例，10%福尔马林固定，常规制成蜡块，进行免疫组织化学染色检查。取正常人皮肤（含正常汗腺组织和毛囊）作为阳性对照，以PBS代替CYLD抗体作为阴性对照。本实验经西安交通大学伦理委员会审核批准。

1.2 实验仪器：YGQ-2158型病理切片机、切片漂烘温控仪、电热恒温培养箱（亚光医用电子技术有限公司）；显微镜（日本，Olympus）。

1.3 实验试剂：①一抗：兔抗人CYLD抗体原液100μl（美国GeneTex 公司）；②SP法免疫组化试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司），包括：二抗（兔抗人lgG，为亲和纯化抗体，可标记长臂生物素）；SP（Streptavidin-perosidase，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）；1.5% BSA（牛血清白蛋白）封闭液；③浓缩型DAB（二氨基联苯胺，3，3-diaminobenzidine）显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）；④PBS缓冲液（磷酸缓冲液，Phosphate Buffer solution ）；⑤10% 水合氯醛；⑥8% 硫化钠。

1.4 实验方法

1.4.1 免疫组化染色：将包埋好的组织蜡块冰冻切成约4μm厚薄片，置于APES载玻片上，随后放入烤箱1h使切片紧密粘附；切片常规脱蜡、晾干；热平台10min修复抗原；0.3% H2O2室温内放置30min以阻断内源性过氧化物酶，蒸馏水冲洗；滴加5% BSA封闭液，放置于室温内约20min；滴加适量一抗，37℃孵育90min；PBS冲洗3次，约3min；滴加适量生物素标记二抗，37℃孵育30min；PBS冲洗3次，约3min；滴加适量SP，37℃孵育30min；PBS冲洗3次，约3min；DAB显色；苏木素复染细胞核，脱水，透明，封片，显微镜观察。其中以PBS缓释液代替一抗作阴性对照。应用光学显微镜观察结果并采用Image-Pro Plus（IPP）图像分析软件采集数据。

1.4.2 Image-Pro Plus（IPP）图像分析软件系统：对免疫组化染色结果进行半定量分析，选择测量参数为：Area、Density（Mean）、IOD。每张切片在400倍的固定视野下随机选取5个视野，测量平均光密度值，取其平均值进行统计学分析。

1.4.3 免疫组化染色质量控制：设置阴性和阳性对照，所有抗体在实验前配制，抗体孵育及DAB显色的温度及时间均固定，结果判定采用单盲法，取正常人皮肤（含正常汗腺组织和毛囊）作为阳性对照，以PBS代替CYLD抗体作为阴性对照。

1.4.4 统计学分析：采用配对设计两样本均数比较的t检验和方差分析。实验数据应用SPSS 18.0软件包进行统计学分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。应用Origin 8.5软件制图。

2 结果

2.1 免疫组化染色结果：正常皮肤组织中，CYLD蛋白在表皮细胞（尤其是基底层和颗粒层细胞）、毛囊、皮脂腺和汗腺的细胞质和细胞核周围区域可见黄色或棕黄色颗粒沉积，均呈阳性表达；苏木素复染细胞核呈蓝色，背景清晰。其次，以PBS代替CYLD抗体制作的阴性对照未见任何非特异性着色。毛发上皮瘤和毛母细胞瘤组织中CYLD蛋白表达水平出现不同程度降低；汗管瘤组织中CYLD蛋白表达水平亦出现下降。见图1。

2.2 半定量分析结果

2.2.1 毛发上皮瘤组（TE组）、毛母细胞瘤组（TB组）和正常人毛囊对照组（NHF组）两两比较结果：TE组CYLD蛋白平均光密度值为（0.214±0.015），TB组为（0.199±0.015），NHF组为（0.335±0.024），经配对t检验，TE组、TB组CYLD蛋白平均光密度值低于NHF组，差异均有统计学意义（t=-13.515，P<0.001；t=-11.403，P<0.001）；TE組和TB组比较，差异无统计学意义（t=1.758，P=0.102）。见图2。

2.2.2 汗管瘤（Syringoma）组和正常人汗腺对照组（NSG组）比较结果：Syringoma组CYLD蛋白平均光密度值为0.228±0.007低于NSG组的0.372±0.017，差异有统计学意义（t=-24.304，P<0.001）。见图3。

3 讨论

CYLD基因是一种重要的肿瘤抑制因子，又称圆柱瘤基因，相关报道提示CYLD基因与肿瘤的发生发展可能密切相关[2]。皮肤附属器肿瘤是一类较罕见但相关的肿瘤组织，这类肿瘤的特点是向表皮附属器分化，而不会向表皮分化，包括毛囊、皮脂腺、顶泌汗腺和小汗腺。某个体也可表现出多种类型分化的肿瘤，因此，皮肤附属器肿瘤具有向多种肿瘤发展的趋势和出现家族综合征的共同特征[3]。毛发上皮瘤（Trichoepithelioma，TE）具有多发性家族型及非家族散发型。多发性家族性毛发上皮瘤（Multiple familial trichoepithelioma， MFT）呈常染色体显性遗传，该病罕见，但少数会恶变为基底细胞癌（Basal cell carcinoma，BCC）或毛母细胞癌；而非家族散发型毛发上皮瘤多与遗传因素无关，有时与圆柱瘤、粟丘疹或汗腺瘤同时存在[4]。张学军等[5]将MFT致病基因定位于16q12-16q13的CYLD基因，近年来，陆续有MFT家系中出现CYLD基因突变的报道，研究小组新发现了一个中国MFT家系中患者位于CYLD基因10号外显子c.1178-1179- delCA（p.T393fs）移码突变，在395位提前出现终止密码[6]。毛母细胞瘤（Trichoblastoma，TB）是一种较少见的毛源性、向滤泡细胞分化的良性皮肤附属器肿瘤[7]；而汗管瘤（Syringoma）为发病率较高的向外分泌腺分化的一种良性腺瘤，组织化学研究证明汗管瘤含典型小汗腺起源的磷酸化酶和水解酶，部分患者有家族史[8]。这三种皮肤良性肿瘤都好发于面部，且随年龄逐渐增多增厚，出现部分融合，个别病例发展为恶变，对患者身心均可造成不良后果。

本次实验结果首先显示CYLD蛋白表达于正常角质形成细胞，增生活跃的基底层和颗粒层细胞中表达较强；皮肤附属器（毛囊、汗腺和皮脂腺）组织细胞中均可见CYLD蛋白阳性表达。初步证明具有去泛素化酶活性的CYLD蛋白在皮肤组织细胞中普遍存在，并在表皮细胞增殖分化中起着一定的作用。也说明表皮中角质形成细胞的生长调节，是通过控制细胞增生和细胞凋亡的平衡来实现的[9]。

本次还观察到，相比于正常毛囊和汗腺，毛发上皮瘤、毛母细胞瘤、汗管瘤患者的肿瘤组织中CYLD蛋白表达水平均显著下降，其中，不仅具有遗传异质性的MFT中CYLD蛋白表达明显下调，目前被认为与遗传因素无关的散发型毛发上皮瘤、毛母细胞瘤和汗管瘤中CYLD蛋白表达亦明显下调，提示与汗腺和毛囊有关的这三种皮肤附属器肿瘤的致病机理均与CYLD蛋白表达下调有关。这与已报道的研究预测一致，皮肤附属器肿瘤的发生可能均由CYLD基因突变所致[10]。

本实验结果不仅显示去泛素化酶活性的CYLD蛋白在正常皮肤、皮肤附属器（毛囊、汗腺和皮脂腺）组织细胞中分布广泛并普遍存在；而且还提示CYLD蛋白的表达下调可能与毛发上皮瘤、毛母细胞瘤、汗管瘤这三种皮肤附属器肿瘤的致病机理有关。表明CYLD蛋白在维持正常皮肤和皮肤附属器组织的正常生理功能、抑制皮肤附属器肿瘤的发生起着非常重要的作用。

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[10]Bowen S，Gill M，Lee DA，et a1.Mutations in the CYLD gene in Brooke-Spiegler syndrome， familial cylindromatosis， and multiple familial trichoepithelioma： lack of genotype-phenotype correlation[J].J Invest Dermatol，2005，124（5）：919-920.

[收稿日期]2018-07-12 [修回日期]2018-08-22

編辑/朱婉蓉