不同剂量(+)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯对大鼠关节炎模型和全血炎症模型的药效学研究*

杨 文， 刘远儒， 李洪林， 王 蕊

(上海市新药设计重点实验室， 华东理工大学药学院， 上海 200237)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种与自身免疫相关的慢性疾病，主要症状为关节肿胀、疼痛和僵硬，病理特征为持续性的滑膜炎症和软骨损伤，最后导致关节畸形[1]。在RA的相关研究中，胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型是最常用也是最接近RA病理特征的一种动物模型，其造模原理为：由于Ⅱ型胶原仅在关节中表达，因此注射外源性的Ⅱ型胶原会引起机体的免疫排异反应，引发关节炎[2-3]。

RA的炎症反应是由一系列的炎症介质介导的，其中，类花生酸是一类重要的脂类炎症介质，由花生四烯酸(arachidonic acid，AA)代谢产生。当细胞受到刺激时，磷脂酶(phospholipase，PL)A2催化细胞核膜上的磷脂水解，释放出游离的AA。AA的代谢途径主要有4条，分别是环加氧酶(cyclo-oxygenase，COX)、5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LOX)、15-LOX和12-LOX，其中，COX通路的代谢产物有前列腺素(prostaglandins，PGs)和血栓素(thromboxanes，TXs)；5-LOX通路的代谢产物有白三烯(leukotrienes，LTs)；15-LOX和12-LOX通路分别生成15-羟基廿碳四烯酸(hydroxyeicosatetraenoic acid，HETE)和12-HETE[4]。这些类花生酸通过与特异性受体结合，激活炎症相关的信号传导通路，从而产生相应的反应[5]。

大花鸡肉参是一种药用植物，紫葳科多年生草本，其根和叶可以入药，具有抗炎镇痛、清热解毒和祛风除湿等功效。(+)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯[(+)-2-(1-hydroxyl-4-oxocyclohexyl) ethyl caffeate，HOEC]是从大花鸡肉参全草中提取分离出的具有抗炎活性的天然产物[6]。Li等[7]研究发现，HOEC在分子水平上对5-LOX和15-LOX有抑制作用，在大鼠腹腔巨噬细胞和人全血中对5-LOX代谢产物LTB4和5-HETE的生成有抑制作用[7]。张卫东课题组先后分别证明了HOEC通过靶向PI3K、ERK1/2和p38 MAPK抑制紫外线诱导的皮肤癌发生和过氧化氢诱导PC12细胞损伤[8-9]。本课题组前期也发表了HOEC通过调节AA代谢网络和p38 MAPK信号通路对过氧化氢和脂多糖诱导的神经损伤有抑制作用的研究[10]。

本研究的目的是对HOEC进行药效学评价及机理探究。在整体药效学研究中，虽然HOEC对大鼠关节炎有治疗效果，但并不符合剂量依赖性，即高剂量HOEC对关节炎的治疗效果反而比中、低剂量HOEC的治疗效果弱。针对这种不同寻常的剂量-药效关系，我们猜想：由于AA的各代谢通路之间的代谢流量存在着相互关联，因此，HOEC对AA代谢酶表达和代谢产物生成均有直接或间接的药理作用。对这种针对复杂代谢通路的药物的效应，不应仅仅由它对靶标酶的作用单独决定，而是应该综合考虑其对各代谢通路的作用。基于上述理论，我们分析了HOEC对大鼠关节组织中AA代谢酶表达的作用；并用大鼠全血AA代谢模型模拟体内的炎症环境，探究HOEC对几种主要AA代谢产物的作用。希望通过上述实验结果的分析，为HOEC在AA代谢通路中的作用及其与药效的关系提供线索。

材 料 和 方 法

1 试剂和材料

6周龄的SPF级雄性Wistar大鼠，购于上海斯莱克实验动物有限公司，合格证编号为2007000575547。动物饲养于温度为(22±1) ℃、相对湿度为50%～60%的动物房中，12 h明亮/黑暗环境，水和食物的供应无限制。大鼠体重为130 g±10 g时开始造模。所有实验程序均符合中国实验动物保健和使用指南。

2 主要试剂

HOEC由华东理工大学药学院李洪林教授实验室合成，纯度> 98%，白色粉末；咖啡酸(caffeic acid, CA)和A23187购自Sigma；牛Ⅱ型胶原(collagen type II, Col II)和不完全弗氏佐剂(incomplete Freund’s adjuvant,IFA)购自Chondrex；EDTA、无水乙醇和二甲苯购自上海泰坦科技有限公司；HE染色试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；生物素标记的山羊抗免IgG和链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-peroxidase，SP)购自武汉三鹰生物技术有限公司；DAB购自北京索莱宝科技有限公司；肝素钠真空采血管购自BD；抗cPLA2抗体(Rabbit Anti-Rat)、抗5-LOX抗体(Rabbit Anti-Rat)和抗COX-2抗体(Rabbit Anti-Rat)购自Affinity Biosciences；LTB4、15(S)-HETE、PGE2、PGD2和TXB2ELISA试剂盒购自Cayman Chemical。

3 主要方法

3.1胶原诱导性关节炎大鼠模型的制备 将牛Col II溶于0.05 mol/L的冰醋酸中，配制成浓度为2 g/L的Col II冰醋酸溶液，将该溶液与IFA按体积比1∶1混合，在冰水浴中用高速匀浆机将其乳化。于起始时点 (即第0天，day 0, D0) 进行首次免疫，将大鼠固定，用乙醇棉擦拭鼠尾消毒，向尾根部皮下注射Col II-IFA混合物(每只200 μg);正常对照(control)组的大鼠以相同的方式注射等体积的灭菌生理盐水。D7进行加强免疫，Col II-IFA混合物的剂量与首次免疫相比减半(每只100 μg)。

3.2给药处理与关节炎评价标准 实验大鼠分组为：正常对照(control)组(8只)、模型(model)组(10只)、HOEC (1 mg/kg)组(10只)、HOEC (3 mg/kg)组(10只)和HOEC (10 mg/kg)组(10只)。给药方式为：从D1～D36，腹腔注射给药，每天1次，分别给予HOEC 10 mg/kg、3 mg/kg和1 mg/kg组的大鼠2、0.6和0.2 g/L的HOEC溶液(含1% DMSO)，5 mL/kg；正常对照组和模型组大鼠给予含有1% DMSO的灭菌生理盐水溶液，体积参照给药组标准。实验期间，每隔3 d对大鼠的体重进行测量，每隔2 d对大鼠的足肿胀情况进行评分。评分标准[11]为：0分者无发红或肿胀；1分者脚趾关节肿胀；2分者脚趾关节和足跖肿胀；3分者踝关节以下的足爪肿胀；4分者踝关节以及足爪肿胀。由于前爪较小不易准确评分且发病率低于后爪，因此关节炎评分的总分为2只后爪评分的总和。

3.3关节组织石蜡切片的制备 于D36实验结束时，断颈处死大鼠，取2只后爪，剥离皮肤和皮下组织，置于固定液(10%中性福尔马林)中，常温浸泡24 h，取出组织，锯下厚度约5 mm的踝关节骨片，换新固定液浸泡48 h，取出置于脱钙液(10% EDTA溶液)中，每日更换新脱钙液，直至组织软化为止。将脱钙后的组织置于活水中浸泡过夜，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，依次浸蜡包埋。将样品切成厚度为3 μm的切片。

3.4苏木素-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色 将石蜡切片置于68 ℃恒温烘箱中20 min，置于二甲苯溶液中脱蜡2次,每次10 min；将切片梯度乙醇复水后，首先将切片置于苏木素溶液中5 min，活水冲洗5 min；然后将切片置于1%盐酸乙醇中分化30 s，活水冲洗30 s，置于蒸馏水中5 min；最后将切片置于0.5%伊红溶液中3 min，活水冲洗30 s。将切片梯度乙醇脱水，二甲苯中透明，封片后将切片置于通风橱中风干24 h以上。

3.5免疫组化观察 采用SP连结法，按照3.4中方法将石蜡切片脱蜡、复水后，依次进行抗原修复，内源性过氧化物酶阻封；滴加适量封闭液(10%山羊血清)，室温下孵育30 min；移除封闭液，用PBST-X按比例(1∶100)稀释I抗(抗cPLA2、5-LOX和COX-2抗体)，滴加适量，4 ℃孵育过夜。次日移除 I 抗，将切片置于PBST-X中，用脱色摇床清洗3次，每次5 min；用PBST-X按比例(1∶400)稀释 II 抗(Biotin-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG)，滴加适量，室温下孵育30 min；移除 II 抗，将切片置于PBST-X中，用脱色摇床清洗3次，每次5 min；用PBS按比例(1∶500)稀释辣根过氧化物酶标记的SP，滴加适量，室温下孵育30 min；移除SP稀释液，将切片置于PBST-X中，用脱色摇床清洗3次，每次5 min；滴加适量显色液，室温下避光显色，反应至显微镜下可见褐色颗粒为止，蒸馏水终止反应，用蒸馏水洗涤2次。最后，按照3.4中方法进行脱水、透明、封片。

3.6全血花生四烯酸代谢模型的建立与药物处理 采用钙离子载体A23187刺激大鼠全血AA代谢模型，分别用0.15 μmol/L和15 μmol/L的HOEC和咖啡酸处理该模型，取30 min和60 min 2个时点的全血样品检测AA代谢产物的浓度。共分为6组：分别是空白对照组、模型组、HOEC和咖啡酸处理组(每组各2个浓度)。麻醉大鼠，从腹主动脉取全血，分装到离心管中，每管1 mL，放置到恒温混匀仪的金属模块中，设置温度为37 ℃，转速为300 r/min；依次向药物处理组中加入10 μL相应浓度的HOEC储存液(100×)和咖啡酸储存液(100×)，向空白对照组和模型组中加入等体积的溶剂(DMSO)，充分混匀，继续孵育；依次向各管全血中加入10 μL Ca2+、 Mg2+储存液(100×)，使其终浓度为2 mmol/L，充分混匀，继续孵育；20 min后，依次向模型组和给药组中加入2 μL A23187 储存液(100×)，使其终浓度为20 μmol/L，充分混匀，此时开始重新计为0 min，继续孵育，随后在各时点从对应离心管中吸取样品，用 3 mL冰乙醇终止反应。将样品保存在-80 ℃中，待处理。

3.7ELISA法测定花生四烯酸代谢产物 将样品在冰上复融，用冷冻离心机在4 ℃、 3 000×g离心15 min。将上清液转移到5 mL离心管中，氮气流吹干，1 mL buffer复溶，分装后置-80 ℃中保存待测。用厂家提供的ELISA法检测样品中的AA代谢产物浓度。

由于每次实验受全血来源差异的影响，AA代谢产物的定量绝对值相差较大，所以我们对数据进行了归一化处理，即以模型组的定量值为基准，将其他组的定量值与模型组做比值，这样既保留了原始数据的趋势，又有利于数据分析。

4 统计学处理

上述实验独立重复3次。实验数据用均数±标准误(mean±SEM)表示。数据分析用IBM SPSS Statistics 16.0进行计算，多组数据之间的比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两比较使用LSD-t检验或以模型组作为对照组的Dunnett’s检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 HOEC对大鼠关节炎模型的药效学评价

模型组的大鼠从D16开始发病，与对照组相比，关节炎评分从D16～D20急剧上升，D20～D24平缓上升，D26～D36平缓下降;HOEC给药组的大鼠与模型组相比均提前2 d开始发病，低剂量组(1 mg/kg)和中剂量组(3 mg/kg)与模型组的关节炎评分变化前期一致，不同的是低、中剂量组D32之后基本稳定，高剂量组(10 mg/kg)的关节炎评分D24开始缓慢下降，D32之后基本稳定，见图1A。3个剂量的HOEC对大鼠关节炎均有治疗效果，其中1 mg/kg和3 mg/kg组的关节炎评分变化曲线非常相近，然而，10 mg/kg组的治疗效果却弱于1 mg/kg和3 mg/kg组，该药效结果并不符合通常情况的剂量依赖性。

和多数报道类似，本研究中模型组的发病率为41.67%；然而，给药组的发病率与模型组相比却均有明显的上升：1 mg/kg组和3 mg/kg组的发病率非常相近，分别为71.43%和66.67%；10 mg/kg组的发病率为84.62%，提示HOEC有可能增加关节炎的发病率，见图1B。在体重变化方面，各组的大鼠体重均呈现上升趋势，其中，正常对照组的大鼠体重呈匀速上升趋势，模型组和给药组的大鼠的体重从D0至D18呈匀速上升趋势，但体重上升速率低于正常对照组，从D18开始，模型组和给药组的大鼠体重维持不变甚至略有下降，直到D24，大鼠体重又恢复上升趋势，见图1C。

2 关节炎大鼠的关节组织形态学变化

正常对照组的大鼠关节组织结构完整清晰；模型组的大鼠关节组织有多处软骨损伤、关节翳，关节组织受损非常严重；HOEC给药组的大鼠关节组织中，1 mg/kg和3 mg/kg组各有一定程度的软骨损伤和关节翳的生成，组织受损情况较轻；10 mg/kg组不仅出现关节翳及软骨损伤，且组织受损情况较严重，见图1D。综上所述，各组大鼠关节组织的损伤情况与该组的关节炎评分基本符合。

Figure 1.Pharmacodynamic evaluation of HOEC on rat CIA model. A: the effect of HOEC on arthritis scores of CIA rats; B: incidence of arthritis in each group; C: weight change curve of each group; D: histological changes of the ankle joints from hind paws of rats. The scale bar=500 μm. c: cartilage; m: meniscus; bm: bone marrow; p: pannus; arrow: cartilage destruction. Mean±SEM. n=10. #P<0.05, ## P<0.01 vs control group (LSD-t test).

3 HOEC对关节炎大鼠关节组织花生四烯酸代谢网络中的关键酶表达水平的影响

免疫组化染色结果显示，与正常对照组相比，模型组cPLA2的表达水平明显升高；给药后，1 mg/kg组的cPLA2表达水平显著下降，然而，随着HOEC剂量的增加，这种下降趋势逐渐消失。HOEC的给药剂量越高，cPLA2的表达水平越高，关节炎评分也相应升高。与正常对照组相比，模型组中5-LOX的表达水平有升高趋势，HOEC能够剂量依赖性地抑制5-LOX的表达。同样，COX-2在模型组中的表达水平与正常对照组相比也显著升高(P<0.05)，给药后，COX-2的表达水平受到抑制，其中1 mg/kg组和3 mg/kg组的抑制作用较强，而10 mg/kg组的抑制效果稍弱,见图2。

4 HOEC和咖啡酸对大鼠全血花生四烯酸代谢模型中代谢产物的影响

30 min时，HOEC 2个浓度(0.15和15 μmol/L)均能抑制LTB4和15-HETE的升高，而对COX通路的3个代谢产物均无明显影响；CA低浓度时(0.15 μmol/L)可明显抑制PGD2的升高；高浓度CA(15μmol/L)作用于细胞后，TXB2的升高受到明显抑制，见图3。上述结果与HOEC在30 min对AA代谢产物的作用情况及分子水平检测到对5-LOX和15-LOX的抑制作用相符。同样作为5-LOX和15-LOX抑制剂的CA[12-13]在30 min时对AA经5-LOX和15-LOX的代谢产物(LTB4和15-HETE)的生成无抑制作用。

Figure 2.The effect of HOEC on the expression of arachidonic acid metabolic enzymes (cPLA2, 5-LOX and COX-2) in the CIA rat ankle joint tissues. A: representative sections of immunochemical staining (scale bar=100 μm) and the average signal intensity (IA/area) calculated using Image-Pro Plus 6.0 software; B: arthritis scores of the rats at D36. Mean±SEM. n=3. *P<0.05 vs control group (Dunnett’s test).

药物处理细胞60 min时，15 μmol/L HOEC 能抑制所有检测的AA代谢产物，并且抑制活性要强于0.15 μmol/L；CA同样表现出了对各被测AA代谢产物不同程度的抑制作用，但 0.15 μmol/L CA对PGD2和TXB2均无抑制，且2个剂量的CA对PGE2、 LTB4和15-HETE的抑制作用量效关系不明显，高浓度抑制作用反而低于低浓度,见图4。

讨 论

为了探究不同剂量HOEC对AA代谢通路的不同作用及其与CIA非剂量依赖性的治疗效果的关系，本文首先检测了各组大鼠关节组织中AA代谢通路的关键酶的表达水平。AA的生成主要是通过PLA2的cPLA2亚型催化细胞核膜上的磷脂分子而释放[14]。与野生型小鼠相比，cPLA2基因敲除的小鼠具有更低的CIA发病率，同时，关节炎的严重程度也较弱[15]。在另一项研究中，cPLA2在CIA大鼠体内表达升高，并与足部厚度的增加呈正相关[16]。在本文中，各组cPLA2的表达水平与关节炎评分呈正相关，这与前述实验结果中cPLA2的表达与CIA关节炎的严重程度具有相关性这一结论一致。COX有COX-1和COX-2 2种亚型，COX-2的表达水平在RA动物模型的关节组织中明显升高，表现为随着疾病的发展不断上升而后趋于稳定，COX-1的表达水平则与正常对照组相差不多[17-18]。本文中CIA模型组的大鼠关节组织中COX-2的表达与正常对照组相比增加，HOEC给药处理之后大鼠关节组织中的COX-2与模型组相比表达水平下调，这不仅说明HOEC对COX-2的表达有抑制作用，也说明HOEC对CIA的治疗作用涉及对COX-2的抑制作用。5-LOX在RA患者的滑膜组织中高水平表达，使用关节内糖皮质激素后，5-LOX的表达水平大幅下降[19]，该结果暗示下调5-LOX的表达水平可对RA起到治疗作用，与本文实验结果相符。

Figure 3.The effects of HOEC and caffeic acid (CA) on AA metabolites in rat whole blood AA metabolic model at 30 min. Mean±SEM. n=3. * P<0.05, ** P<0.01 vs control group; #P<0.05 vs model group (Dunnett’s test).

Figure 4.The effects of HOEC and caffeic acid (CA) on AA metabolites in rat whole blood AA metabolic model at 60 min. Mean±SEM. n=3. **P<0.01 vs normal group; #P<0.05, ##P<0.01 vs model group (Dunnett’s test).

为了进一步探究HOEC对AA代谢产物的作用与其对CIA非剂量依赖性治疗效果的关系，本文接下来对HOEC和其在体内的主要代谢物咖啡酸对大鼠全血的AA代谢模型中代谢产物的作用进行了研究。COX通路的代谢产物PGE2在RA患者的滑膜液和尿液中均有升高[20]，同时它也是产生疼痛和肿胀的主要炎症介质[21]；LOX通路的代谢产物LTB4在RA患者的血清、滑膜液和滑膜组织中均有升高[22]；TXA2通过其受体TXA2R既可控制COX-2的表达，又可介导COX-2的细胞增殖效应[23]，本文中TXB2在HOEC和CA处理后均受到抑制作用，该现象可能与上述2种药物的抗炎作用有关。此外，COX通路的代谢产物PGD2在RA中具有抗炎作用[24]，而关于15-HETE与12-HETE在RA中的作用尚不明确。

HOEC对AA代谢通路的作用如下：(1)30 min时，由于细胞受到A23187的刺激，AA代谢通路中的代谢酶被激活，活性酶的数量不断增加，AA和代谢产物的生成速率随之升高，由于HOEC对5-LOX和15-LOX的抑制活性较高，所以表现出了对LTB4和15-HETE生成的抑制作用；(2)60 min时，由于A23187的持续刺激，AA代谢通路中被激活的代谢酶数量趋于饱和，各代谢产物的生成速率小于代谢速率，表现为各代谢产物产量的降低，推测60 min时HOEC对COX通路代谢产物的抑制作用可能与全血中细胞-细胞之间的相互作用有关。

咖啡酸是一种具有5-LOX和15-LOX抑制作用的抗炎活性物质，而它的一些脂类或酰胺类衍生物较其具有更高的抗炎和抗氧化活性，如咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester，CAPE)等。有文献报到，当咖啡酸的浓度为10 μmol/L时，尚不能对毒胡萝卜素诱导的多形核白细胞中5-LOX的激活产生抑制效果[25]；当咖啡酸的浓度大于50 μmol/L时，才对氧化偶氮甲烷诱导的肝和结肠肌黏膜中5-LOX的激活表现出抑制作用[26]，上述结果提示，咖啡酸的最低有效浓度较高。此外，咖啡酸有抑制PGE2生成的作用，但没有明显的剂量依赖性[27]；而在同一研究中，CAPE对LTB4、LTC4和PGE2均有剂量依赖性的抑制。我们推测咖啡酸pKa(酸解离常数)较小，脂溶性较差，而咖啡酸的衍生物由于其结构的修饰导致脂溶性增加从而具有更好的成药性，相应地，抗炎活性也有所提高。HOEC作为一种咖啡酸酯，在30 min时也表现出了较咖啡酸更强的抑5-LOX和15-LOX活性。

本文从组织中酶的表达水平和全血中炎症介质的变化2个方面探究了HOEC可能的药物作用机理。HOEC是一种具有抗炎活性的多靶点天然产物，在抗炎药物的开发中，由于炎症介质代谢网络的复杂性和关联性，多靶标药物的开发已经成为一种主流的抗炎药物研发方向。因此，研究HOEC的药物作用机制有助于理解多靶标抗炎药物对炎症网络的作用。目前，对于HOEC的研究主要存在2个未解决的问题：(1)没有掌握全部药物作用靶点的信息，不能清楚地解释其对COX表达水平和COX通路代谢产物的抑制作用机制；(2)HOEC在体内极易水解代谢，无法通过体外的研究结果还原体内的作用机制。总的来说，对HOEC体内药效评价和作用机制的研究为以后多靶标抗炎药物的研究提供了实践经验和思考。