FGF-21和Nrf2对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响*

周 淼， 李风雷， 孙俊波

(1河南中医药大学第三附属医院肺病科， 河南 郑州 450000； 2河南省中医院， 河南 郑州 450002)

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是过多的纤维胶原沉积在肺间质内的一种慢性进行性疾病，其主要特征表现为炎症细胞因子的积累，成纤维细胞过度增殖和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的大量沉积等，其发病过程和机制尚不明确。近年来大量研究表明氧化与抗氧化作用失衡引发的氧化应激是IPF发病的主要机制之一。

成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor-21，FGF-21)属于FGF家族成员之一。它通过抑制活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的产生而抑制氧化应激反应[1-3]。研究报道发现FGF-21通过激活核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)保护小鼠肝脏免受D-半乳糖诱导的氧化应激和细胞凋亡[4]。此外，FGF-21通过激活Nrf2抑制巨噬细胞介导的炎症反应，表明FGF-21具有抗炎作用[5]。FGF-21通过下调纤维化因子IV型胶原蛋白、纤溶酶原激活物抑制物1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)和转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)进而抑制肾纤维化[6]。但是FGF-21在博莱霉素(bleomycin,BLM)所致的肺纤维化中的作用机制尚未见报道。

本课题拟采用气管内滴注BLM的方法建立小鼠肺间质纤维化模型，探讨FGF-21和Nrf2对BLM诱导的炎症反应及氧化应激所致的小鼠肺间质纤维化的作用，并进一步探讨其对肺间质纤维化相关分子作用机制的影响，以期寻求新的治疗策略。

材 料 和 方 法

1 实验材料

博莱霉素购自日本化药株式会社；BCA购自Beyotime；PVDF膜购自Merk millipore；抗I型胶原蛋白(collagen I)、纤连蛋白(fibronectin)、Nrf2和GAPDH抗体购自Sigma；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase，GPx)及羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)检测试剂盒均购自中国南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6和TGF-β1的ELISA试剂盒购自博士德生物工程有限公司；Nrf2-siRNA(Si-Nrf2)和阴性对照siRNA(negative control siRNA, si-NC)慢病毒载体购自南京凯基生物公司。

2 方法

2.1动物模型构建及分组处理 40只昆明小鼠由第四军医大学提供，许可证号为SKXY(陕)2014-001，随机分为5组，即对照(control)组、BLM组及不同剂量的FGF-21(1、2及5 mg/kg)处理组。将BLM溶于无菌生理盐水中，对各组小鼠进行水合氯醛麻醉后，对除正常对照组外其余组以3 mg/kg的剂量对其进行气管内滴注，制作小鼠肺损伤模型，正常对照组小鼠则滴注等量生理盐水。然后根据分组情况腹腔注射不同剂量的FGF-21(1、2及5 mg/kg)，每天1次，连续21 d；另取小鼠分别经尾静脉注射1×108PFU的si-Nrf2慢病毒载体和si-NC空载体，隔天注射一次。最后一天处死小鼠，留存小鼠肺组织及血清样本。本研究中的所有动物实验操作流程均应严格遵循《实验动物保护条例》。

2.2Western blot检测蛋白水平 取0.1 g肺组织，匀浆后抽提总蛋白。用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白含量。取20 μg蛋白行10% SDS-PAGE，然后转PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入抗collagen I、fibronectin和Nrf2抗体，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次，加入 II 抗(HRP标记)室温孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL发光自显影。以目的蛋白条带密度与GAPDH条带吸光度比值表示目的蛋白的相对水平。

2.3肺组织ROS含量的检测 取不同处理组小鼠肺组织匀浆4 μL，加入396 μL PBS稀释100倍。取100 μL稀释液于酶标板中排列，并加入100 μL荧光染料DCFA染色，避光反应5 min，用荧光酶标仪检测。

2.4抗氧化指标MDA、SOD和GPx的检测 按照试剂盒说明书检测不同处理组肺组织中MDA含量及SOD和GPx活性。

2.5ELISA检测炎症因子的表达水平 采用ELISA试剂盒分别检测不同处理组肺组织中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β1的表达水平，严格按照说明书进行操作。

2.6HYP含量的检测 不同处理组小鼠肺组织匀浆后取上清，然后根据HYP测试盒说明书操作。

3 统计学处理

应用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5.0软件分别进行数据分析及作图，数据均以均数±标准差(mean±SD)表示。两组间计量资料比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 FGF-21抑制BLM诱导的炎症应答

与control组相比，BLM组TNF-α、IL-1β和IL-6的含量显著升高(P<0.05)，而相对于BLM组，FGF-21明显降低这些炎症因子的分泌水平，且呈剂量依懒性(P<0.05)，表明FGF-21能够减轻IPF过程中的炎症反应，见图1。

Figure 1. The effect of FGF-21 on BLM-induced inflammatory response. The levels of inflammatory mediators TNF-α (A), IL-1β (B) and IL-6 in the lung tissues were measured by ELISA. Mean±SD. n=8.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs BLM group.

2 FGF-21抑制BLM诱导的氧化损伤

相比control组，BLM组胞内ROS的含量显著增加(P<0.05)，而经FGF-21处理后，ROS的产生明显降低(P<0.05)，见图2A。BLM组肺组织中MDA含量显著升高，经过FGF-21处理后，肺组织中MDA的含量明显降低(P<0.05),见图2B。BLM组SOD和GPx的活性较control组显著降低(P<0.05)，而FGF-21处理后明显增加SOD和GPx的活性(P<0.05)，见图2C、2D。这些结果提示FGF-21防治肺纤维化的作用可能与提高机体的抗氧化能力有关。

Figure 2.The effect of FGF-21 on BLM-induced oxidative stress. A: the production of ROS was measured by DCFH-DA staining; B, C and D: the content of MDA and the activity of SOD and GPx were detected by commercially available kits. Mean±SD. n=8. *P<0.05 vs control group; # P<0.05 vs BLM group.

3 FGF-21降低BLM诱导的胞外基质分泌

BLM组肺组织中的collagen I和fibronectin蛋白水平较control组显著上调(P<0.05)，FGF-21处理组肺组织中这2种蛋白的表达较BLM组明显下调(P<0.05),见图3A。 BLM组肺组织中TGF-β1的表达水平相比control组增高(P<0.05)，FGF-21处理后其表达明显降低(P<0.05)，见图3B。此外， BLM组中HYP的含量显著高于control组，而FGF-21处理明显减少HYP含量(P<0.05),见图3C。

4 Nrf2信号参与调控FGF-21的抗肺纤维化作用

与BLM组相比，FGF-21明显上调Nrf2的表达水平(P<0.05)，表明FGF-21能够激活Nrf2信号通路，见图4A。沉默Nrf2的表达明显恢复炎症因子IL-1β和IL-6的水平(P<0.05)，见图4B，并增加了ROS的产生(P<0.05)，见图4C，说明沉默Nrf2的表达能够逆转FGF-21介导的抗炎作用及抗氧化应激作用，提示FGF-21可能通过上调Nrf2表达、增加Nrf2活性而减轻BLM所致的肺纤维化。

Figure 3.The effects of FGF-21 on BLM-induced extracellular matrix production. A: Western blot analysis was used to determine the protein expression of collagen I and fibronectin; B: the expression level of TGF-β1 was measured by ELISA; C: the content of HYP was measured by commercially available kit. Mean±SD. n=8. * P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs BLM group.

Figure 4.FGF-21 suppressed BLM-induced pulmonary fibrosis by activating Nrf2. A: the protein expression of Nrf2 was determined by Western blot; B: the levels of inflammatory mediators IL-1β and IL-6 in the lung tissues were measured by ELISA; C: the production of ROS was measured by DCFH-DA staining. Mean±SD. n=8. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs BLM group; &P<0.05 vs FGF-21+BLM+si-NC group.

讨 论

博莱霉素诱导的肺纤维化模型早期主要表现为肺泡炎症，继而出现成纤维细胞异常增生及细胞外基质形成增多和沉积，最终出现肺纤维化。本研究采用气管内滴注BLM的方法建立小鼠特发性肺间质纤维化模型。

肺纤维化发病过程中，肺组织中的中性粒细胞分泌大量的细胞因子和趋化因子,如TNF-α、IL-1β和IL-6，破坏机体内炎症系统/抗炎系统之间的平衡，从而破坏正常的肺组织结构[7-8]。在BLM诱导的肺纤维化模型肺组织中TNF-α、IL-1β和IL-6含量显著升高；经FGF-21处理后，肺组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量明显降低，该结果表明FGF-21防治肺纤维化的作用可能与其抗炎能力有关。

氧化应激损伤被认为是导致和促进肺纤维化病理进程的一个重要因素，是IPF的重要发病机制[9]。ROS在肺纤维化发生、发展的病理生理过程中扮演重要角色。越来越多证据表明BLM诱导肺纤维化是由于BLM能够促进ROS产生，增加氧化物负担，使得肺内氧化物、抗氧化物失衡。MDA是自由基作用于脂质后发生或氧化反应的终产物，是氧化应激的标志物；SOD是一种重要的内源性抗氧化酶，具有清除氧自由基的作用。GPx是清除H2O2与有机过氧化物的重要抗氧化酶。有研究发现氧化损伤可降低FGF-21的表达量，表明FGF-21与氧化应激存在一定的关系[10]。本研究结果发现在BLM诱导小鼠肺纤维化模型中，ROS生成及MDA含量显著升高，且SOD和GPx等抗氧化酶活性均显著降低，提示肺组织发生增强的氧化应激，使脂质过氧化产物增多；FGF-21处理后能够明显逆转这种现象。综合上述结果表明FGF-21缓解BLM造成的肺纤维化，可能与抑制自由基过氧化物的生成、增加抗氧化酶活性进而减轻氧化应激反应发挥其抗纤维化的作用。

TGF-β1能介导成纤维细胞的趋化、增殖及分化，促进细胞外基质合成、聚集及减少细胞外基质降解等效应，被认为是肺纤维化过程最关键细胞因子。HYP是胶原的降解产物，可作为BLM诱导肺纤维化病变的重要指标。该结果表明FGF-21减少BLM诱发的肺纤维化的间质胶原沉积，下调TGF-β1的表达水平，并降低肺内的HYP的含量而起到抗纤维化的作用。

有研究发现Nrf2在IPF中低表达，且Nrf2激活能够增加抗氧化防御及肌纤维母细胞的去纤维化[11]。此外，FGF-21通过减少肾脂积累和抑制炎症、氧化应激和纤维化，从而缓解了FFA及糖尿病引起的肾损害[12]。另有研究表明Nrf2能够正调控FGF-21的表达[13]。与前期研究结果一致，在纤维化小鼠模型中，FGF-21能够激活Nrf2信号，更为重要的Nrf2沉默能够阻断FGF-21的抗炎及抗氧化应激作用，表明Nrf2参与FGF-21介导的抗纤维化保护效应。