二甲双胍联合紫杉醇对人乳腺癌细胞凋亡及AMPK信号通路的影响*

梁君伟， 方志华， 李青山△

(1承德医学院附属医院肿瘤科， 2承德市第三医院胸腹外科，河北 承德 067000)

乳腺癌是一种发生于乳腺组织异质性的恶性肿瘤，是一种女性常见的疾病。据统计，近年来乳腺癌的发病率居高不下，死亡率逐渐增加，严重危害女性的健康[1]。虽然乳腺癌的治疗技术有了巨大的提高，主要治疗手段包括手术、化疗、放疗及内分泌治疗等，其中化疗是乳腺癌常用的治疗手段，有研究表明，紫杉醇(paclitaxel)类化合物对乳腺癌有确切的疗效，是目前国际公认的抗肿瘤药物，但大多数患者易产生耐药性[2-4]。因此研究增强紫杉醇化疗敏感性的药物是临床治疗的重点和难点。二甲双胍(metformin)是一种传统的胰岛素增敏剂, 常用于治疗2型糖尿病。近几年研究表明，二甲双胍参与肿瘤的发生、发展，并具有降低发病风险、改善预后的作用[5-7]。本研究通过采用二甲双胍联合紫杉醇作用于人乳腺癌MCF-7细胞系，观察其对细胞活力及凋亡的影响，探讨二甲双胍和紫杉醇联合作用对乳腺癌细胞的协同作用，同时检测一磷酸腺苷活化的蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)通路蛋白、Bax和Bcl-2等的表达，探讨药物与AMPK信号通路和Bcl-2家族的关系及相关机制。

材 料 和 方 法

1 实验材料

人乳腺癌细胞系MCF-7(原位雌激素受体阳性乳腺癌细胞系)购自中科院上海细胞库；二甲双胍购自中国药品生物制品检定所；紫杉醇注射液购自上海康耀药业有限公司，RPMI-1640培养基和胎牛血清购自杭州四季青公司；MTT和二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)购自Amresco；0.25%胰酶购自Sigma；细胞裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂盒和鼠抗人P21抗体购自北京中杉金桥有限公司；鼠抗人β-肌动蛋白(β-actin)抗体、兔抗人AMPKα抗体和鼠抗人caspase-3抗体购自Cell Signaling Technology；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 II 抗购自北京康为公司；鼠抗人Bcl-2抗体和鼠抗人Bax抗体购自武汉联科有限公司。酶标仪购自Thermo；凝胶成像系统和荧光定量PCR仪购自Bio-Rad。

2 方法

2.1细胞的培养 乳腺癌MCF-7细胞培养于RPMI-1640培养基中，加入10%胎牛血清并置于37 ℃、5% CO2、100%湿度下培养，待细胞贴壁生长并铺满瓶底，加入0.25%胰酶消化、传代，继续培养，取生长状态良好的对数期细胞用于后续实验。

2.2MTT法检测不同浓度二甲双胍作用下细胞的活力 收集对数期的MCF-7细胞，以合适密度接种于96孔板上，加入180 μL不同浓度(2、5、10、20、40和80 mmol/L)二甲双胍培养细胞，每组设置5个平行孔，以不加药物作为对照，置于培养箱中培养48 h后，每孔加入20 μL MTT，继续培养4 h；吸弃孔内溶液，每孔加入150 μL DMSO，摇床中振荡5 min，酶标仪中检测490 nm波长下各孔吸光度(A)值，实验重复5次，取平均值。

2.3二甲双胍联合紫杉醇对细胞活力的影响 收集对数期细胞，随机分为对照组、二甲双胍组、紫杉醇组、联合组及联合+compound C组，对照组细胞常规培养，根据临床常规剂量和参考文献[8]，采用选取2.4 mg/L紫杉醇、2 mmol/L的二甲双胍单独或者联合培养细胞，联合+compound C组细胞中加入AMPK信号通路抑制剂compound C (50 μmol/L)，置于细胞培养箱中培养 48 h，加入20 μL MTT和150 μL DMSO，测定细胞490 nm波长下各孔A值。

2.4二甲双胍联合紫杉醇对细胞凋亡的影响 根据凋亡试剂盒说明书的指示，将对照组、二甲双胍组、紫杉醇组、联合组及联合+compound C组细胞浓度调整为1×109/L，培养24 h后，每孔加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，4 ℃染色15 min，流式细胞术分析细胞的凋亡率。

2.5RT-qPCR检测细胞凋亡相关分子的mRNA水平 采用RT-qPCR法观察二甲双胍联合紫杉醇对Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA表达的影响。收集各组细胞，密度调整为4×106个，加入1 mL TRIzol试剂，充分溶解细胞，提取细胞中总mRNA。吸取3 μL 细胞总RNA，加入逆转录酶，反转录为cDNA。利用Primer 5.0软件设计目的基因的引物序列并由上海生工公司合成，见表1。扩增体系为25 μL：12.5 μL PCR Mix，引物上、下游各0.5 μL，2 μL cDNA，加入双蒸水补足至25 μL。扩增条件为： 95 ℃ 5 min； 95 ℃ 30 s，各退火温度 30 s，72 ℃ 38 s，40个循环。实验重复3次，以β-actin为内参照，以2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

2.6二甲双胍联合紫杉醇对细胞凋亡蛋白以及AMPK信号通路蛋白表达量的影响 收集各组细胞，洗涤、离心后，加入含PMSF的细胞裂解液，冰上裂解30 min，吸取上清，BCA法检测蛋白浓度后稀释。洗净、晾干玻璃板，灌入12%的分离胶至预定高

表1 RT-qPCR的引物序列

度，并加入双蒸水液封，室温下静置1 h。配制5%浓缩胶，弃去双蒸水，加入浓缩胶，插入梳子，室温静置30 min。将配置好的凝胶板置于电泳槽中，加入电泳液；将蛋白样品与5×样品缓冲液混合，煮沸5 min，每孔加入10 μL样品，进行电泳；浓缩胶电压调整至80 V，分离胶电压为100 V，电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。采用300 mA电流转膜60～90 min，将凝胶中的蛋白转移至硝酸纤维膜中。加入5%脱脂奶粉封闭2 h；加入 I 抗稀释液，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min；加入相应 II 抗稀释液，37 ℃孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min；曝光、显影、显色，凝胶成像系统测定其灰度值，分析目的蛋白与内参照β-actin的灰度值比值，实验重复3次，取平均值。

3 统计学处理

SPSS 22.0软件进行统计处理，结果以均数±标准差(mean±SD)表示，多组数据间的比较采用单因素方差分析，组间两两比较使用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 不同浓度二甲双胍对乳腺癌MCF-7细胞活力的影响

MTT结果显示，在给予不同浓度(2、5、10、20、40和80 mmol/L)的二甲双胍培养乳腺癌MCF-7细胞48 h后，不同浓度二甲双胍均能抑制MCF-7细胞生长，并且抑制作用随着二甲双胍浓度的增加逐渐增强；其中二甲双胍在2 mmol/L时即可抑制细胞的活力，所以后续实验以二甲双胍2 mmol/L为处理因素，见图1A。

2 二甲双胍联合紫杉醇对乳腺癌MCF-7细胞活力的影响

与对照组相比，2.4 mg/L紫杉醇和2 mmol/L的二甲双胍单独使用可显著抑制细胞的生长(P<0.05)；联合使用的抑制作用较单独使用时增强(P<0.05)；与联合组相比，加入AMPK信号通路抑制剂compound C可显著削弱二甲双胍和紫杉醇抑制细胞活力的作用(P<0.05)，见图1B。

Figure 1.The effect of metformin combined with paclitaxel on the viability of breast cancer MCF-7 cells. A: the effect of metformin at different concentrations on the viability of breast cancer MCF-7 cells; B: the effect of metformin combined with paclitaxel on the viability of breast cancer MCF-7 cells. Mean±SD. n=3. * P<0.05 vs control group; # P<0.05 vs metformin group or paclitaxel group; △ P<0.05 vs combination group.

3 二甲双胍联合紫杉醇对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响

与对照组相比，2.4 mg/L紫杉醇和2 mmol/L的二甲双胍单独使用可显著促进细胞的凋亡(P<0.05)；联合使用促凋亡作用较单独使用时增强(P<0.05)；加入compound C可显著削弱二甲双胍和紫杉醇促进细胞凋亡的作用，与联合组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

Figure 2.The effect of metformin combined with paclitaxel on the apoptosis of breast cancer MCF-7 cells. Mean±SD. n=3. * P<0.05 vs control group; # P<0.05 vs metformin group or paclitaxel group; △ P<0.05 vs combination group.

4 二甲双胍联合紫杉醇对MCF-7细胞凋亡相关分子mRNA和蛋白表达的影响

RT-qPCR和Western blot结果显示，二甲双胍和紫杉醇单独或者联合使用均可显著调节Bcl-2、Bax和caspase-3的表达量。与对照组相比，2.4 mg/L紫杉醇和2 mmol/L的二甲双胍单独使用可显著上调Bax和caspase-3的mRNA和蛋白水平(P<0.05)，下调Bcl-2的mRNA和蛋白水平(P<0.05)；联合使用较单独使用时显著促进Bax和caspase-3的mRNA和蛋白水平(P<0.01)，抑制Bcl-2的mRNA和蛋白水平(P<0.01)；加入compound C可显著削弱二甲双胍和紫杉醇促进细胞Bax和caspase-3 mRNA和蛋白水平及抑制Bcl-2 mRNA和蛋白水平的作用，与联合组相比，差异有统计学意义(P<0.01)，见图3。

Figure 3.The effects of metformin combined with paclitaxel on the mRNA and protein levels of Bcl-2, Bax and caspase-3 in the MCF-7 cells. A: the relative expression of mRNA; B: the relative protein levels. Mean±SD. n=3. * P<0.05 vs control group; # P<0.05 vs metformin group or paclitaxel group; △ P<0.05 vs combination group.

5 二甲双胍联合紫杉醇对AMPK信号通路的影响

与对照组相比，2.4 mg/L紫杉醇和2 mmol/L的二甲双胍单独使用可显著促进AMPKα和P21蛋白表达(P<0.05)；联合使用的促进作用较单独使用时增强(P<0.05)；加入compound C较联合组可显著抑制AMPKα和P21蛋白表达(P<0.05)，见图4。

Figure 4.The effect of metformin combined with paclitaxel on the expression of AMPK signaling pathway-related proteins. Mean±SD. n=3. * P<0.05 vs control group; # P<0.05 vs metformin group or paclitaxel group; △P<0.05 vs combination group.

讨 论

近年来，乳腺癌患者的预后不良以及复发等问题是临床治疗面临的重要问题，其主要原因是化疗耐药性的出现以及化疗敏感性差。因此，寻找增强化疗敏感性药物是临床医师研究的重点和难点。二甲双胍是一种胰岛素增敏剂，具有疗效好、安全性高及副作用少等特点。临床上常使用二甲双胍调节糖代谢，改善糖尿病患者高血糖的状态。但近年来的研究发现，二甲双胍具有抗肿瘤作用，可显著抑制卵巢癌、肝癌、宫颈癌和喉癌等肿瘤细胞的生长、分化[9-12]。临床上研究发现，患有糖尿病的病人口服二甲双胍可降低肿瘤的发病率，且并发有卵巢癌和子宫癌时，患者的预后也较好[13]。因此，研究二甲双胍对肿瘤的治疗作用具有广泛的临床应用前景。紫杉醇是临床上常用的肿瘤化疗药物，但易产生耐药性，且副作用如消化道异常、骨髓抑制等经常出现，严重影响肿瘤患者的生活质量和预后。其中化疗耐药性是乳腺癌患者死亡的主要原因。本实验结果显示，二甲双胍对乳腺癌MCF-7细胞增殖具有显著抑制性，且具有一定的浓度依赖性，并可诱导细胞凋亡，与紫杉醇联合作用具有协同抗乳腺癌细胞增殖的作用。因此二甲双胍和紫杉醇联合使用可能是一个有效治疗乳腺癌的方法，为临床二者联合治疗乳腺癌提供理论依据。

AMPK信号通路是组织细胞中最重要的能量代谢调节通路之一，对于维持组织细胞内AMP/ATP的比例、调控蛋白与脂肪的合成与分解，以及细胞的应激均有重要的作用。近年来研究发现，AMPK信号转导通路还参与了对肿瘤细胞增殖与凋亡过程的调控[14-16]。研究表明，二甲双胍可直接或间接激活细胞中AMPK[17-18]。二甲双胍可阻碍细胞线粒体呼吸链复合体的电子传递过程，降低三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)的合成，促使细胞内一磷酸腺苷(AMP)的水平增加，升高AMP/ATP的比例，从而间接活化AMPK。现已证实，当AMPK信号通路被激活时，可引起细胞内P21途径的活化，从而阻滞细胞周期进程[19]。在本实验中，Western blot检测结果发现，二甲双胍、紫杉醇单独或联合使用作用于MCF-7细胞，AMPKα和P21的表达量均上调，且联合用药较单独用药AMPKα和P21表达上调更明显，加入AMPK信号通路抑制剂compound C可缓解二甲双胍和紫杉醇的协同促进作用，进一步表明二甲双胍联合紫杉醇可能是通过激活AMPK，激活P21途径，调控下游靶基因的表达，进而发挥抑制MCF-7细胞活力、诱导细胞凋亡的作用。

肿瘤的发生与肿瘤细胞的过度增殖和凋亡减少有关。细胞凋亡是一个多基因调控的复杂过程，受到抑制细胞凋亡基因和促进细胞凋亡的基因的共同调控。Bcl-2家族是调控细胞凋亡的重要蛋白，其中Bcl-2抑制细胞凋亡，Bax促进细胞凋亡。在细胞内，二者可结合成异质二聚体而失活，而当二者的相对表达量失衡时，可破坏线粒体膜的完整性，最终激活caspase-3，引起细胞凋亡进程的改变[20-22]。已有研究发现，二甲双胍能抑制抗凋亡的 Bcl-2 的表达，促进促凋亡的 Bax 的表达，促进细胞发生凋亡[23]。本研究的结果发现，在乳腺癌细胞中，二甲双胍和紫杉醇可显著抑制Bcl-2的表达，促进Bax和caspase-3的表达，表明二甲双胍和紫杉醇能使MCF-7细胞中Bcl-2蛋白表达下调、Bax蛋白水平上调，最终促进凋亡终末效应因子caspase-3的表达增加，诱导细胞凋亡，从而抑制乳腺癌MCF-7细胞的生长。

综上所述，二甲双胍联合紫杉醇可通过激活AMPK信号转导通路，调控P21途径和细胞凋亡蛋白的水平，激活细胞凋亡信号通路，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。