肝素酶在医药领域应用的研究进展

刘文丽，蒋莹子，赵丽青，张培新，王淑兰



肝素酶在医药领域应用的研究进展

刘文丽1，蒋莹子1，赵丽青1，张培新1，王淑兰2

1 深圳大学 化学与环境工程学院，广东 深圳 518060 2 东北大学理学院，辽宁 沈阳 110819

刘文丽, 蒋莹子, 赵丽青, 等. 肝素酶在医药领域应用的研究进展. 生物工程学报, 2018, 34(12): 1953–1962.Liu WL, Jiang YZ, Zhao LQ,et al. Research progress of heparinase in the field of medicine. Chin J Biotech, 2018, 34(12): 1953–1962.

肝素酶是一类能够特定切割肝素或硫酸乙酰肝素中α-1,4糖苷键并将其裂解成有活性寡糖片段的酶，主要分为真核生物肝素酶 (Heparanase) 和原核生物肝素酶 (Heparinase)。由于原核生物肝素酶是一种高效绿色的生物催化剂，因此近年来在医药领域的应用性研究逐渐被重视。文中结合本课题组相关工作，归纳介绍了原核生物肝素酶通过作用于硫酸肝素蛋白聚糖 (HSPGs) 生成肝素小分子，抑制肿瘤细胞增殖方面的应用；原核生物肝素酶在制备第三代创新型抗凝血药物低分子量肝素 (Low molecular weight heparin, LWMH) 和超低分子量肝素(Ultra low molecular weight heparin, ULMWH) 方面的应用；原核生物肝素酶作为肝素拮抗药物等医药领域的重要应用；并展望了原核生物肝素酶的未来应用前景及挑战。

肝素酶，肿瘤治疗，肝素拮抗药物，低分子量肝素，超低分子肝素

肝素酶是一类能够特定切割肝素或硫酸乙酰肝素中α-1,4糖苷键并将其裂解为有活性寡糖片段的酶，因其高效、绿色的特点吸引了科研工作者对其在医药领域应用的研究兴趣。目前，国内外对乙酰肝素酶在医药领域应用的综述比较多，对于肝素酶在医药领域应用的研究综述较少。与以前的肝素酶综述相比，笔者结合本课题组近几年对原核生物肝素酶研究的结果，综述了原核生物肝素酶通过作用于硫酸肝素蛋白聚糖 (HSPGs)生成肝素小分子，抑制肿瘤细胞增殖方面的应用；原核生物肝素酶在制备第三代创新型抗凝血药物低分子量肝素 (Low molecular weight heparin, LWMH) 和超低分子量肝素 (Ultra low molecular weight heparin, ULMWH) 方面的应用；原核生物肝素酶作为肝素拮抗药物等医药领域的重要应用。其中利用课题组自筛选的拉乌尔菌属sp. NX-TZ-3-15和普罗威登斯菌属NX-XC-12产生的原核生物肝素酶已成功制备出分子量和Factor Xa: IIa活性均具有优势的超低分子肝素ULMWH。

1 肝素酶简介

1.1 肝素酶的定义和分类

肝素 (Heparin, HP) /硫酸乙酰肝素 (Heparan sulfate, HS)，是由D-乙酰氨基葡萄糖中20–100个不饱和单元形成的线性链组成的，其中D-乙酰氨基葡萄糖通过α-1,4糖苷键连接到葡萄糖醛酸上，其结构见图1[1-2]。

HP/HS是粘多糖 (Glycosaminoglycans, GAGs) 中的一员，具有一定的生理功能, 一般用作抗凝血药物等[3]。现发现不管真核生物还是原核生物，都会产生降解HP/HS的酶，这些真核生物和原核生物体内的内切酶 (糖苷内切酶) 可以特定切开HP/HS残基中多聚糖链内的糖苷键，因此统称这一类酶为肝素酶[3]。其中，真核生物产生的肝素酶称为类肝素酶或乙酰肝素酶 (Heparanase)，是以水解方式降解HS，而原核生物产生的肝素酶称为原核生物肝素酶，是以裂解的方式降解HP或HS。Heparanase能够水解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 (HSPGs) 的肝素类侧链破坏细胞外基质 (ECM) 和基底膜 (BM) 的基本结构，从而释放并激活连接在Heparin类侧链上的活性物质，它与血管生成、肿瘤转移、炎症等病理过程密切相关[3]。Heparanase在人类肿瘤中是优先表达的，在低转移性肿瘤组织细胞中的过度表达能促进肿瘤细胞扩散和血管化，从而引起癌症的恶化。而在非侵入性和非免疫组织中表达的Heparanase对在胚胎发育和成人阶段的组织成形、再生和修复等方面有重要作用。酶原和活性状态的Heparanase对成骨细胞[4]、神经系统发育和神经细胞分化[5-7]等生物功能有重要作用。微生物源肝素酶主要分3种：原核生物肝素酶Ⅰ(EC 4.2.2.7)、原核生物肝素酶Ⅱ、原核生物肝素酶Ⅲ (乙酰肝素酶，EC 4.2.2.8)。这3种纯化的原核生物肝素酶，在切割HP和HS的能力上有所不同。原核生物肝素酶Ⅰ只能裂解肝素，裂解肝素重复单位中的HNS.6X-IIS键，产生△-4,5位不饱和糖醛酸，留下1个还原性末端；原核生物肝素酶Ⅱ底物选择性最宽，对HP和HS中的HNY.6X-U2x键均有切割作用；原核生物肝素酶Ⅲ 特定切割HS，切割HNAC-Ⅰ和HNY.6X-G键。其中，原核生物肝素酶Ⅰ和原核生物肝素酶Ⅲ 需要钙离子激活，而原核生物肝素酶Ⅱ不需要钙离子激活。

图1 肝素结构示意图

1.2 肝素酶的来源

1.2.1 真核生物来源的Heparanase

真核生物来源的Heparanase主要表达于细胞非浸润组织和非免疫组织，负责人类胚胎发育和成人阶段的组织形成、修复和再生；优先表达于低转移性的肿瘤细胞，如黑色素瘤和癌症细胞[8-10]等，促进肿瘤细胞的入侵和血管化，导致癌症的发生。

1.2.2 微生物来源的原核生物肝素酶

原核生物肝素酶最早是从肝素黄杆菌(前人称其为) 中发现的，是一种能够裂解Heparin的微生物，同时还会产生外切糖苷酶、磷酸二酯酶和磺胺类酶等进一步作用于酶解产生的低聚糖产物。

除了从中分离出原核生物肝素酶外，国内外学者还先后从鞘氨醇杆菌属和芽孢杆菌属中分离出原核生物肝素酶，这些细菌主要来源于土壤[11]和食物研磨废物[12]。此外，近些年还有一些学者发现分别来源于人体肠道、人体牙周和土壤中的粪便拟杆菌[13]、黄曲霉[14]和不动杆菌[15]产生原核生物肝素酶，但至今尚不明确土壤细菌产生原核生物肝素酶的原因，猜测可能是土壤细菌可利用原核生物肝素酶去降解腐尸中的GAGs。据报道，从人类肠道中分离出的粪便拟杆菌HJ-15能够产生原核生物肝素酶[13]。所有这些原核生物肝素酶在pH 8.5–10下都是带正电荷的，这可能与其可降解高度聚阴离子基质的天然本质有关。这些酶与从中分离出的原核生物肝素酶相比，在分子量、等电点、氨基酸组成以及动力学性质上都有所不同。此外，利用抗体实验、氨基酸分析测序、肽质量指纹图谱以及DNA印迹法等方法比较来自于不同细菌的原核生物肝素酶，发现没有很大的相似性。Yoshida等[16-18]研究表明，在基因序列上和推导出的氨基酸序列上与酸性多糖裂解酶家族用以降解硫酸软骨素和透明质酸的酶有部分相似[17]。Hyun等[13]的研究表明HJ-15的重组原核生物肝素酶Ⅲ与来自的原核生物肝素酶Ⅱ有70%的同源性。Dzvova等的研究结果表明铜绿假单胞菌UCBPP-PA14能够产生原核生物肝素酶，类似于原核生物肝素酶Ⅱ[19]。Chaudhary等从韩国京畿大学的森林土壤中分离出菌株K-4-11-1能够产生原核生物肝素酶[20]。作者所在课题组于2017年于土壤中分离出sp. NX-TZ-3-15和NX-XC-12，经天青A法证实均产生原核生物肝素酶，并经过初步分离纯化，目前已达到电泳级纯度。现已报道的和笔者分离出的一些原核生物肝素酶的来源及基本性质见表1。

表1 原核生物肝素酶来源及基本性质

2 Heparinase在医药领域的应用

2.1 Heparinase在肿瘤治疗中的应用

众所周知，癌症的肿瘤细胞增殖和二次转移是不可控制的。肿瘤组织可分为3个室 (Compartments)，分别为肿瘤细胞室、内皮细胞室和细胞外基质室 (Extracellular matrix, ECM)，ECM干涉肿瘤细胞室和内皮细胞室，并且调控整个细胞室。硫酸肝素蛋白聚糖 (Heparan sulphateproteoglycans, HSPGs) 以及结构蛋白是ECM细胞表面的重要组成部分。HSPGs所在的位置有助于调控细胞扩散和转移，从而控制肿瘤的生长和血管生成[23]。在内皮细胞表面上的HSPGs是各种促血管生成生长因子的共受体，如成纤维细胞室生长因子 (FGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF) 和抗血管生成因子 (内皮抑素)[24]。一些研究结果表明Heparin对肿瘤扩散、血管生成以及新陈代谢等有一定影响[25-27]。新血管的形成是肿瘤生长、入侵和新陈代谢过程中的致病中心步骤，肿瘤通过新血管的形成获得养分，而原核生物肝素酶通过作用于HSPGs，生成Heparin小分子，抑制毛细血管内皮细胞的增殖，抑制新血管形成，从而达到抑制肿瘤细胞增殖的作用[28-29]。原核生物肝素酶Ⅰ、Ⅱ 和Ⅲ 的抗血管生成活性不同，导致生成的肝素小分子的功效不同，抑制肿瘤细胞的能力也不同。原核生物肝素酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 抑制新血管形成从而抑制肿瘤增殖的作用机制与其在受体结合水平上改变FGF的功能有关[30-32]，研究发现毛细血管内皮细胞 (EC) 经原核生物肝素酶处理后会极大地降低其与FGF结合能力，结果表明，经125 nmol/L原核生物肝素酶Ⅰ处理后，FGF的结合能力将损失95%。FGF结合硫酸肝素和受体位点的能力减少到50%，抑制肿瘤细胞增殖的能力也减少到50%，原核生物肝素酶Ⅰ的浓度为0.5 nmol/L和1.5 nmol/L时，抑制FGF结合的能力最强；当原核生物肝素酶Ⅱ的浓度是2 nmol/L和8 nmol/L时，抑制FGF结合的能力最强；原核生物肝素酶Ⅲ 的浓度是0.15 nmol/L和0.2 nmol/L时，抑制FGF结合的能力最强[34]。

2.2 原核生物肝素酶在研究HP/HS精确结构中的应用

HP/HS作为粘多糖中的一员，分子结构非常复杂，至今该类物质的化学结构和成分分析仍是糖生物化学中的难题之一。研究HP/HS的序列是深入了解HP/HS结构的有效方法，主要利用原核生物肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 裂解HP/HS多糖序列，由于裂解位置的不同，从而获得特定的序列信息。利用原核生物肝素酶裂解HP/HS可以直接测定HP/HS结构，因为原核生物肝素酶在切割HP和HS时有着高度的底物专一性，切割HP和HS中的α-1,4糖苷键并产生含有非还原性4,5-不饱和糖醛酸残基的双糖，这一过程涉及了由一种或多种混合原核生物肝素酶裂解HP/HS的过程，是一个由长链解聚成二糖组分的过程，包含非还原末端的己糖醛酸差向异构体在C4和C5间形成C=C双键时消失的结构信息，对于明确由肝素产生的寡糖结构具有非常重要的意义，不仅可以了解Heparin与蛋白质的相互作用，还可以确定Heparin与蛋白质结合所需的精确结构。Rabenstein[35]通过原核生物肝素酶Ⅰ裂解Heparin获得具有抑制血管平滑肌细胞活性的小分子Heparin，研究发现大于14个单糖单位的小分子Heparin具有完全抑制血管平滑肌的细胞活性。总之，原核生物肝素酶作为一类能够特异性地将肝素粘多糖裂解成有活性的寡糖片段的工具酶，可用于分析Heparin类物质及其产生寡糖的结构与功能，从而进一步了解Heparin的构效关系，促进Heparin类物质的生物化学、生理和病理作用的研究。

2.3 利用原核生物肝素酶制备LWMH和ULWMH

Heparin是一种糖胺聚糖类天然药物，于1916年[34]被Mclean发现具有抗凝血功能。1935年开始被用作临床抗凝药物，成为仅次于胰岛素的第二大类天然产物药物[35]，全球年产值达100亿美元，主要用于暴发性流脑、血栓塞、肾炎、败血症、动脉硬化、急性心肌梗塞等疾病的治疗。我国是世界第一大Heparin生产国，近年的Heparin产量约占世界总量的60%。

目前，Heparin类药物主要有三代：标准Heparin、LWMH和ULWMH。LWMH是第二代创新型药物，临床应用证明LWMH在引起患者血小板减少、骨质疏松、出血等副作用优于Heparin，因此近年来LWMH已取代大部分Heparin的市场，现有伊诺肝素 (Enoxaparin)、达肝素 (Dalteparin)、亭扎肝素 (Tinzaparin)、舍托肝素 (Sandoparin)、那曲肝素 (Nadroparin) 等著名药物 (一些LWMH及性质见表2)。ULWMH平均分子量小于4 000 Da，拥有比LWMH更高的抗FXa活性和更低的抗IIa活性，能够穿透血脑屏障，出血风险更低，在治疗急性缺血性中风等疾病方面副作用更小[36]，因此成为Heparin类抗凝血药物的未来发展趋势。ULWMH现已开发的产品主要包括：由ROVI公司研发的Bemiparin，在欧洲上市多年；由赛诺菲-安万特研发的Semuloparin，正在进行临床研究，Bemiparin和RO-14是目前唯一商业化的ULWMH。1998年，Bemiparin被允许应用到美国以外的国家，用于内科病人初级静脉血栓的预防和一般的外科手术和整形手术病人二级静脉血栓的预防[37]。Bemiparin是通过降解猪小肠粘膜分离的Heparin制备得到的[38]，健康的志愿者服用Bemiparin的药物代谢动力学结果表明，Bemiparin的抗FXa活性是随着剂量增加而增加的，工业化生产的Bemiparin抗FXa活性/抗IIa活性已经达到8。据统计，直到2014年，Bemiparin的销售额已经达到7 270万欧元，市场还在进一步拓展，2015年，Bemiparin在中国上市。RO-14是利用化学降解Heparin生产Bemiparin的派生物，健康的志愿者服用RO-14药物代谢动力学结果表明RO-14具有很好的安全性，活性和剂量成正比[39]。Semuloparin是由赛诺菲-安万特研发的一种用来预防癌症化疗患者静脉血栓的药物，需要每日连续给药，它主要是通过解聚猪粘膜Heparin制备得到的[40]。工业化生产的Semuloparin抗FXa活性/抗IIa活性已达到80，其临床Ⅲ期试验在意大利、英国、丹麦、德国、加拿大等多个国家已经展开，2012年2月发表于杂志上的临床研究结果表明该药能够减少患者血栓的发生，对患者生存期的延长影响不大，且存在出血风险，因此FDA拒绝批准该药物，赛诺菲-安万特公司于2012年7月停止对该药物的研究[41-44]。Deligoparin是国际上研发的第4个ULWMH，但在研究过程中，利用Deligoparin作为抗炎药物治疗结肠炎患者过程中，未能达到良好效果，从而Deligoparin的研究被终止[37]。Fondaparinux是2016年最新报道的超低分子肝素，可用来治疗视网膜静脉阻塞，据报道取得了较好的疗效[46]。

表2 低分子肝素和超低分子肝素

图2 Heparinase降解Heparin为LMWH图解[45]

目前，国内外生产ULWMH都是通过化学降解的方法制备的，但化学方法制备的ULWMH具有收率低、反应条件剧烈、操作步骤繁琐等缺点，而原核生物肝素酶裂解法作用比较温和且环境友好，是一种比较理想的工业生产方法 (图2)。原核生物肝素酶作用程度是通过测定与产品分子中形成的不饱和糖醛酸残基相关联的吸光度变化来监测的，通过除去酶或使酶失活的方法终止酶促反应。当原核生物肝素酶裂解Heparin完全，去除分子量小的副产品 (如双糖和四糖)，制备得到ULMWH。

2.4 原核生物肝素酶作为Heparin拮抗药物在临床应用的研究

病人在进行心肺转流 (CPB) 外科手术时，为了抑制凝血系统的激活，需要利用强抗凝血酶来使病人维持全身抗凝状态。在体外循环、心血管外科和其他的人工干预过程中，Heparin被长期用来作为抗凝血药物来控制血液的凝固。但是，利用Heparin作为抗凝血药物的使用过程中，多达10%–15%的病人会出现出血并发症。在心血管外科手术过程中，一旦病人手术结束，Heparin的抗凝作用需要立即失效从而阻止病人的大量出血，临床上使用鱼精蛋白抵抗Heparin抗凝血作用，鱼精蛋白早已作为标准Heparin拮抗药物投入使用，并已是美国唯一批准使用的肝素拮抗药物，鱼精蛋白的肝素拮抗效率与总的阳离子电荷相关。但它也会产生许多不良反应，包括可造成病人全身性低血压、肺水肿、肺血管收缩以及过敏反应等[39]，因此，取代鱼精蛋白的新型肝素拮抗药物的开发迫在眉睫。

原核生物肝素酶Ⅰ能够特定地使Heparin失去活力，因此可作为鱼精蛋白的替代品。一些研究已经证实原核生物肝素酶Ⅰ能够在体外将Heparin诱导的抗凝血作用逆转，并且在狗和兔子等动物模型中作为Heparin诱导抗凝血拮抗药物与鱼精蛋白进行比较，研究结果表明原核生物肝素酶Ⅰ作为抗凝血作用的拮抗药物并不改变血液动力学，当剂量达到30 μg/kg时，原核生物肝素酶Ⅰ能够成功地中和Heparin的抗凝作用，没有明显的后遗症[40]。2001年Viskov等[41]对进行冠状动脉干道手术治疗的49名患者进行注射原核生物肝素酶Ⅰ酶解肝素，研究其中和活性和安全性评估，结果发现，对于患者来说，给予7–10 μg/kg剂量的原核生物肝素酶Ⅰ，能有效地储存激活凝血时间 (ACT)，原核生物肝素酶Ⅰ不会引起临床上明显的血液动力学或者其他方面的不良反应。此外，原核生物肝素酶Ⅰ在完全消除Heparin抗凝血活性的同时只是部分消除抗Xa凝血因子的活性，抗Xa凝血因子的活性随着原核生物肝素酶代谢肝素后的剩余量的变化而变化。

3 展望

肝素酶在医药领域的应用范围较广泛，可作为抗肿瘤治疗新靶点、生产LWMH和ULWMH、作为肝素拮抗药物等。但对于肝素酶应用于一些医药领域的作用机制研究还不是很透彻，深入地阐述肝素酶在医药领域应用的作用机制，将更有利于开发出新的应用领域，有利于改造肝素酶，使其更好地应用于相应的医药领域。同时，解析HP/HS微结构和生物活性，将有利于深入了解原核生物肝素酶与底物Heparin之间的裂解机制，从而更好地揭示不同微生物来源的原核生物肝素酶的进化关系，提升和发展原核生物肝素酶在各种临床应用上的潜力。

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(本文责编 郝丽芳)

Research progress of heparinase in the field of medicine

Wenli Liu1, Yingzi Jiang1, Liqing Zhao1, Peixin Zhang1, and Shulan Wang2

1 College of Chemical and Environmental Engineering, Shenzhen University, Shenzhen 518060, Guangdong, China 2 College of Sciences, Northeastern University, Shenyang 110819, Liaoning, China

Heparinases can produce biologically active oligosaccharides by specifically cleaving the α-(1,4) glycosidic linkages of heparin and heparan sulphate. Heparinases are divided into heparinase and heparanase. Because heparinase is an effective biocatalyst, more and more researchers pay attention to the application of heparinase in medical field in the recent years. Combined with the related research work in our group, the application value of heparinase in the medical field was summarized, such as the determination of the structure of heparin, the preparation of low-molecular-weight heparin and ultra-low-molecular-weight heparin, tumor therapy and as a heparin antagonist. In addition, we summarized the definition, source of heparinase and its application in the medicine field. Heparinases have a great application prospect in the field of medicine.

heparinase, tumor therapy, heparin antagonists, low-molecular-weight heparin, ultra low molecular weight heparin

February 22, 2018;

April 27, 2018

The 60th Financial Grant from China Postdoctoral Science Foundation (No. 2016M602534),the Youth Innovation Talents Project of Gerneral Higher School in Guangdong Province (No. 2016KQNCX144), the National Natural Science Foundation of China (Nos. 21606152, 31701621), the Natural Science Foundation of Guangdong Province, China(No. 2016A030313053), the Special Fund for Development of Strategic Emerging Industries in Shenzhen (No. JCYJ20160520174823939).

Liqing Zhao. Tel/Fax: +86-755-26770395; E-mail: snowzlj@163.com

中国博士后科学基金第60批面上项目 (No. 2016M602534)，广东省普通高校青年创新人才项目 (No. 2016KQNCX144)，国家自然科学基金 (Nos. 21606152，31701621)，广东省自然科学基金-自由申请项目 (No. 2016A030313053)，深圳市战略新兴产业发展专项资金 (No. JCYJ20160520174823939) 资助。

2018-05-14

10.13345/j.cjb.180068

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180511.1800.004.html