腺苷酸活化蛋白激酶在肾脏纤维化中的研究进展

刘慧铭 王圆圆 郭兵

[摘要]腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是机体内重要的能量感受调节器，广泛存在于真核生物中。AMPK不仅能调节能量代谢，还有促进自噬、诱导凋亡、调节氧化应激和抗炎症等作用。越来越多的研究发现，AMPK可以通过调节氧化应激、抑制多条致纤维化信号通路等来防止肾脏纤维化的发生。因此，AMPK有望成为肾脏纤维化防治的新方法。AMPK及其抑制肾脏纤维化的相关机制将为临床上肾脏纤维化的防治提供新的靶点和依据。

[关键词]腺苷酸活化蛋白激酶；糖尿病；肾脏纤维化；氧化应激

[中图分类号] R339.21 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）9（b）-0027-04

[Abstract] Adenylate-activated protein kinase （AMPK） is an important energy-sensing regulator in the body， and is widely present in eukaryotes. AMPK can not only regulate energy metabolism， but also promote autophagy， induce apoptosis， regulate oxidative stress and anti-inflammatory effects. More and more studies have found that AMPK can prevent renal fibrosis by regulating oxidative stress and inhibiting multiple fibrotic signaling pathways. Therefore， AMPK is expected to become a new method for the prevention and treatment of kidney fibrosis. AMPK and its related mechanisms for inhibiting renal fibrosis will provide new targets and basis for clinical prevention and treatment of renal fibrosis. This article gives a brief review of the relationship between AMPK and kidney fibrosis.

[Key words] Adenylate-activated protein kinase； Diabetes； Renal fibrosis； Oxidative stress

腎脏纤维化是各种肾脏疾病终末期的主要病理特征和最终通路，其本质为机体失败的自身损伤修复过程，目前尚无特异性治疗方法。肾脏固有细胞的激活、增殖甚至分化转换导致细胞外基质的大量沉积和肾小球硬化是肾脏纤维化形成的关键。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是重要的能量感受器，能调节机体能量的代谢平衡。近年来研究显示，糖尿病治疗药物二甲双胍可以通过激活AMPK来抑制肾脏纤维化；同时也有文献报道，AMPK的其他激动剂如5-氨基4-酰胺咪唑核糖核苷酸（5-Aminoimidazol-4-carboxamde1-β-D-ribofuranoside，AICAR）可以通过激活AMPK达到抑制肾脏纤维化的作用。因此，AMPK抑制肾脏纤维化的相关机制已成为临床上肾脏纤维化防治的研究热点，以期为抗击肾脏纤维化提供新的药物靶点。本文就AMPK和肾脏纤维化的关系进行简要综述。

1 AMPK的结构和活性调节

1.1 AMPK的结构

AMPK复合物存在于几乎所有的真核生物中，不同物种的AMPK蛋白均以一种异源三聚体复合物的形式存在，由一个催化亚基（α1或α2）、支架β亚基（β1或β2）和调节性γ亚基（γ1，γ2和γ3）构成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物，且所有亚基都由独立的基因编码。AMPKα亚基含有参与复合物形成的N端激酶结构域和C端结构域， N端是催化核心部位， 其Thr172 位点的磷酸化被作为AMPK激活的标志。AMPK的β亚基在其N端部分含有碳水化合物结合模块（CBM），其C端部分有参与结合AMPKα和AMPKγ亚基的αγ-亚基结合序列（αγ-SBS）结构域， β亚基的C末端部分充当与α和γ亚基相互作用的支架，可以连接α、γ亚单位一起形成AMPK异构体的核心部位。γ亚基有4个串行重复的CBS区域，以相邻两个CBS区域为一个Bateman结构域，用于选择性结合AMP或ADP。

1.2 AMPK的活性调节

AMPK的激活通常依赖α亚基N端“激活环”中保守的172位苏氨酸残基（Thr172）发生磷酸化，但这并非绝对，在Scott等[1]的实验中，在Thr172未被磷酸化的情况下，小分子药物A769662依然能够激活AMPK且其活性水平近似磷酸化Thr172的状态。AMPK的激活一般认为有两种方式： ①AMP变构激活AMPK：AMP或模拟细胞AMP的小分子通过连接到γ亚基引发了AMPK复合物的构象变化，从而进一步磷酸化AMPKα亚基中Thr-172位点激活AMPK，而AMP与AMPKγ的结合也使得AMPK Thr172 位点不易被磷酸酶脱磷酸化而失活。②AMPK上游激酶AMPKK：丝氨酸-苏氨酸激酶11（serine/threonine kinase11，LKB1）、转化生长因子β 激活蛋白激酶1（TGF-β-activated kinase 1，TAK1）和钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶激酶β（calmodulin-dependent proteinkinase kinase β，CaM KKβ），均通过磷酸化α亚基上Thr172位点激活AMPK。关于AMPK的激活剂近年来研究广泛[2]，主要分为直接激活剂和间接激活剂。直接激活剂包括AICAR、噻吩并吡啶酮（A-769662）和苯并咪唑（化合物911）衍生物、水杨酸盐以及Compound-13等等；而间接激活剂，实际上AMPK可以被任何能导致AMP或钙积累的调节剂激活，这些激活剂被归类为间接激活剂，如双胍类、噻唑烷二酮（也可称作格列酮类）、多酚（如白藜芦醇、槲皮素和小檗碱等）、人参皂苷、α-硫辛酸等。

2 AMPK的生物学功能

AMPK不仅能调节能量代谢，还有促进自噬、诱导凋亡、调节氧化应激和抗炎症等作用。AMPK磷酸化激活下游靶蛋白而增强产能代谢反应并抑制耗能代谢途径，从而维持细胞能量稳态。AMPK是自噬通路的上游分子，相关研究显示，AMPK可以通过直接磷酸化蛋白激酶复合物ULK1和脂质激酶复合物PI3KC3/VPS34来激活自噬[3]，从而发挥生物学效应。诱导细胞凋亡方面，活化的AMPK可磷酸化肿瘤抑制蛋白p53上的丝氨酸15位点（Ser15），促使p53在线粒体聚集并诱导细胞凋亡；AMPK还可以磷酸化激活c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK），JNK进而激活转录因子激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）促进促凋亡蛋白Bim转录最终诱导细胞凋亡，而JNK也可直接磷酸化激活Bim来调节凋亡。激活AMPK可以减少活性氧的积累，从而减轻氧化应激的作用，并通过增加还原型辅酶Ⅱ的合成以及限制其分解，最终达到保护细胞免受氧化应激的破坏[4]。AMPK的抗炎效应多伴有对核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的抑制作用，AMPK主要通过下游沉默信息调节因子SIRT1、转录因子FoxO3a、抑癌基因p53、过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α等间接调节NF-κB活性， 抑制炎性因子表达以发挥抗炎作用[5]。

3 AMPK在纤维化过程中的作用

纤维化是由原发性炎性损伤、效应细胞的调节和ECM分泌三个紧密相连的过程组成的动态反应，其实质是效应细胞对各种因素导致组织细胞损伤引起的炎症的增生修复过程。在纤维化的第一阶段，受损的细胞释放细胞因子如IL-1和肿瘤坏死因子（TNFα）等，细胞因子募集炎症细胞介导炎症反应并促进纤维化。C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白-6（CTRP6）是一種新发现的脂联素旁系同源物，其通过激活AMPK抑制了TGF-β1和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达，而用AMPK抑制剂处理后消除了CTRP6对TGF-β1诱导的心肌纤维化的保护作用，提示AMPK改善了炎症诱导的纤维化[6]。在细胞因子与生长因子持续不停地刺激下，效应细胞（如成纤维细胞、肝星状细胞和间充质细胞等）呈现持续活化增殖状态并合成大量的细胞外基质（extracellular matrixc，ECM）成分，而受损细胞可发生表型转换转化为肌成纤维细胞，此阶段是纤维化发生的重要阶段。Lu等[7]用TGF-β诱导肾成纤维细胞分泌I型胶原蛋白，而二甲双胍通过激活AMPK下调Smad3从而下调结缔组织生长因子（CTGF）抑制了胶原的产生，最终抑制间质纤维化。柯萨奇B3病毒诱导新生儿心脏成纤维细胞增殖和胶原分泌增加，而通过AICAR激活AMPK可抑制柯萨奇B3病毒诱导的心脏纤维化[8]。Qiu等[9]发现在体内、体外敲低AMPKα2后，β-catenin和Smad3上调，增强了肾脏上皮细胞向间充质转换（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和肾纤维化。这些发现提示敲低AMPK或抑制AMPK活性可加重组织器官的纤维化，而激活AMPK可抑制组织器官纤维化的发生发展，AMPK在纤维化的发生发展中发挥着重要作用。

4 AMPK抑制肾脏纤维化的相关机制

4.1 AMPK与氧化应激

氧化应激是氧化与抗氧化防御机制的失衡，导致多种信号通路的异常激活，从而产生大量的活性氧和脂质过氧化代谢产物，最终导致组织过氧化损伤。肾脏纤维化的发生、发展与氧化应激密切相关。氧化应激反应不仅导致肾脏内环境改变和肾固有细胞受损，持续的过氧化刺激促进细胞外基质的沉积加快肾脏纤维化进程。更重要的是，氧化应激过程中产生大量的活性氧类（reactive oxygen species，ROS）作为重要的细胞内第二信使，活化多条致肾脏纤维化信号转导通路，包括TGF-β1/Smads、 PI3K/Akt/mTOR、MAPK、ERK等信号通路来促进肾脏纤维化的发生发展。AMPK在高糖刺激下失活引起ROS生成增多，ROS激活ERK1/2信号通路诱导肾成纤维细胞增殖和活化加快肾纤维化进程[10]。Shin等[11]使用抗氧化剂，包括N-乙酰半胱氨酸（NAC，ROS清除剂），NOX抑制剂（apocynin），线粒体电子抑制剂转移链亚单位I（mitoQ）缓解了TGF-β1诱导的人腹膜间皮细胞的EMT，并发现二甲双胍可通过激活AMPK来调节氧化应激，增强抗氧化物如超氧化物歧化酶（superoxide orgotein dismutase，SOD）的活性和表达，减少ROS的生成，从而缓解人腹膜间皮细胞的EMT和纤维化。Hong等[12]发现，在糖尿病肾病中，细胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD）通过激活AMPK发挥肾脏保护作用，包括改善db/db小鼠的蛋白尿、系膜扩张和间质纤维化等。

4.2 AMPK与PI3K/Akt /mTOR信号通路

PI3K/Akt/mTOR信号通路是一条介导肾脏纤维化的信号通路[13]。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，蛋白激酶B（Akt）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，能够磷酸化数种蛋白，下游效应蛋白为雷帕霉素靶体蛋（mammalian targetofrapamycin，mTOR）。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其蛋白复合物mTORC1激活可以调节下游代表性信号分子4E结合蛋白（4EBP）和磷蛋白70 S6激酶（p70S6K），从而促进蛋白合成和细胞增殖，导致肾小球肥大、系膜基质沉积以及肾小球基底膜增厚，加重肾脏纤维化进程。在高糖刺激体外培养的肾小管上皮细胞和用STZ造模后的糖尿病大鼠肾脏皮质中均发现mTORC1/p70S6K高度活化和EMT，而AMPK激活剂槲皮素可以在体内和体外抑制mTORC1/p70S6K活化从而抑制肾小管上皮细胞向间充质转换和肾脏纤维化[14]。Dong等[15]研究发现，AMPK可以通过下调mTOR来缓解高糖刺激诱导的肾小管上皮细胞EMT，提示AMPK可能通过mTOR通路发挥对肾脏纤维化的抑制作用。

4.3 AMPK與足细胞的自噬

足细胞为高度特化的细胞，参与肾小球滤过膜的构成，对于基膜更新、维持基膜通透性等有重要功能，足细胞损伤或缺失将促使肾小球硬化。正常生理状态下的足细胞具有较高的自噬活性，通过溶酶体降解衰老的细胞器、大分子蛋白和有害物质，并将降解产物送至胞浆重新利用，以维持自身动态平衡。AMPK影响自噬的主要通路有两条，即细胞质中AMPK-mTOR信号通路和细胞核内AMPK-SKP2-CARM1信号通路。在葡萄糖缺乏时，AMPK通过直接磷酸化Ser 317和Ser 777位点直接激活ULK1来促进自噬[16]，在细胞核内，AMPK磷酸化核转录因子FOXO3a来抑制SKP2的转录，导致精氨酸甲基转移酶1（CARM1）蛋白水平升高，CARM1通过调控转录因子EB（TFEB）对自噬相关基因和溶酶体基因发挥转录激活自噬的功能[17]。用遗传学方法敲除小鼠中LC3基因以抑制自噬，导致肾脏中胶原蛋白的表达和沉积增加，促进肾纤维化[18]，肾脏自噬受损与糖尿病肾病的发病有关，自噬的恢复具有肾脏保护作用[19-20]。哺乳动物mTOR可以抑制自噬[21]，而激活AMPK可抑制mTOR信号通路并促进多种细胞的自噬。Jin等[22]实验表明，小檗碱可以通过促进AMPK活化增强足细胞自噬并防止了高糖引起的足细胞损伤。Kim 等[23]研究显示脂联素通过脂联素受体通过激活细胞内Ca2+/LKB1-AMPK/过氧化物酶体增殖物激活受体-α（PPARα）途径改善足细胞损伤，对糖尿病肾病（DN）发挥肾脏保护作用。

4.4 AMPK的下游靶蛋白（tuberin）

tuberin是由一种抑癌基因TSC2编码的生长抑制蛋白，该基因胚系突变可导致结节性硬化症。tuberin被证实为AMPK的下游靶蛋白，AMPK可以通过直接磷酸化其特定残基如Ser1387将其激活[24]。Thakur等[25]的研究表明，在TGF-β1转基因小鼠的肾皮质中，AMPK和tuberin的磷酸化均显着降低，同时伴有纤连蛋白、α-SMA的升高以及钙粘蛋白的降低，纤维化指标明显，这种变化与TGF-β刺激下的肾小管上皮细胞变化一致，加入AMPK激动剂如二甲双胍后，可以增加tuberin的活化并逆转TGF-β诱导的纤维化效应，提示活化的AMPK通过磷酸化tuberin的Ser1387位点来发挥抑制纤维化的效应。

5总结与展望

目前糖尿病终末期肾病患者的数量依旧在稳步增加且尚无有效治疗方案，因此开发有效的抗肾脏纤维化药物就显得尤为重要。AMPK可以通过调节氧化应激、自噬和抑制多条致纤维化信号通路来防止糖尿病肾脏纤维化的发生，积极探索AMPK的下游靶点将有助于明确AMPK的调节肾脏纤维化的具体机制。然而，目前关于AMPK抗纤维化的下游靶蛋白并未完全明确，AMPK的具体抗纤维化作用机制尚未完全探索清楚。明确AMPK的抗纤维化详细机制及其更多的下游靶点的发现将为抗纤维化药物的药物筛选靶点提供有力支撑，对防治肾脏纤维化具有重大意义。

[参考文献]

[1]Scott JW，Ling NM，Issa SM，et al.Small molecule drug A-769662 and AMP synergistically activate naive AMPK Independent of upstream kinase signaling[J].Chem Biol，2014，21（5）： 619-627.

[2]Kim J，Yang G，Kim Y，et al.AMPK activators：mechanisms of action and physiological activities[J].Exp Mol Med，2016， 48：e224.

[3]Egan DF，Shackelford DB，Mihaylova MM，et al.Phosphorylation of ULK1（hATG1）by AMP-activated protein kinase connects energy sensing to mitophagy[J].Science，2011，331（616）：456-461.

[4]Yang M，Huang Y，Chen J，et al.Activation of AMPK participates hydrogen sulfide-induced cyto-protective effect against dexamethasone in osteoblastic MC3T3-E1 cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2014，454（1）：42-47.

[5]Park CS，Bang BR，Kwon HS，et al.Metformin reduces airway inflammation and remodeling via activation of AMP-activated protein kinase[J].Biochem Pharmacol，2012，84（12）：1660-1670.

[6]Lei H，Wu D，Wang JY，et al.C1q/tumor necrosis factor-related protein-6 attenuates post-infarct cardiac fibrosis by targeting RhoA/MRTF-A pathway and inhibiting myofibroblast differentiation[J].Basic Res Cardiol，2015，110（4）：35.

[7]Lu J，Shi J，Li M，et al.Activation of AMPK by metformin inhibits TGF-β-induced collagen production in mouse renal fibroblasts[J].Life Sci，2015，127：59-65.

[8]Jiang S，Tian S，Wu X，et al.Effect of AMP-activated protein kinase activation on cardiac fibroblast proliferation induced by coxsackievirus B3[J].Exp Ther Med，2016，11（6）：2547-2552.

[9]Qiu S，Xiao Z，Piao C，et al.AMPKα2 reduces renal epithelial transdifferentiation and inflammation after injury through interaction with CK2β[J].J Pathol，2015，237（3）：330-342.

[10]He T，Xiong J-C，Nie L，et al.Resveratrol inhibits renal interstitial fibrosis in diabetic nephropathy by regulating AMPK/NOX4/ROS pathway[J].J Mol Med （Berl），2016，94（12）：1359-1371.

[11]Shin HS，Ko J，Kim DA，et al.Metformin ameliorates the phenotype transition of peritoneal mesothelial cells and peritoneal fibrosis via a modulation of oxidative stress[J].Sci Rep，2017，7（1）：5690.

[12]Hong YA，Lim JH，Kim MY，et al.Extracellular superoxide dismutase attenuates renal oxidative stress through the activation of adenosine monophosphate-activated protein kinase in diabetic nephropathy[J].Antioxid Redox Signal，2018，28（17）：1543-1561.

[13]Yang JJ，Huang YR，Wang YG，et al.Regulative mechanisms of in glomerular hypertrophy in diabetic nephropathy and interventional effects of Chinese herbal medicine[J].Zhongguo Zhong Yao Za Zhi，2015，40（16）：3125-3131.

[14]Lu Q，Ji XJ，Zhou YX，et al.Quercetin inhibits the mTORC1/p70S6K signaling-mediated renal tubular epithelial-mesenchymal transition and renal fibrosis in diabetic nephropathy[J].Pharmacological Res，2015，99：237-247.

[15]Dong D，Cai GY，Ning YC，et al.Alleviation of senescence and epithelial-mesenchymal transition in aging kidney by short-term caloric restriction and caloric restriction mimetics via modulation of AMPK/mTOR signaling[J].Oncotarget，2017，8（10）：16109-16121.

[16]Kim J，Kundu M，Viollet B，et al.AMPK and mTOR regulate autophagy through direct phosphorylation of Ulk1[J].Nat Cell Biol，2011，13（2）：132-141.

[17]Shin HJ，Kim H，Oh S，et al.AMPK-SKP2-CARM1 signalling cascade in transcriptional regulation of autophagy[J].Nature，2016，534（7608）：553-557.

[18]Ding Y，Kim S I，Lee SY，et al.Autophagy regulates TGF-beta expression and suppresses kidney fibrosis induced by unilateral ureteral obstruction[J].J Am Soc Nephrol，2014，25（12）：2835-2846.

[19]Ding Y，Choi ME.Autophagy in diabetic nephropathy[J].J Endocrinol，2015，224：R15-R30.

[20]Xu Y，Liu L，Xin W，et al.The renoprotective role of autophagy activation in proximal tubular epithelial cells in diabetic nephropathy[J].J Diabetes Complications，2015，29：976-983.

[21]Li J，Gui Y，Ren J，et al.Metformin protects against cisplatin-induced tubular cell apoptosis and acute kidney injury via AMPKα-regulated autophagy induction[J].Sci Rep，2016，6（4）：23975.

[22]Jin YL，Liu SP，Ma QS，et al.Berberine enhances the AMPK activation and autophagy and mitigates high glucose-induced apoptosis of mouse podocytes[J].Eur J Pharmacol，2017，794（1）：106-114.

[23]Kim Y，Lim JH，Kim MY，et al.The adiponectin receptor agonist adiporon ameliorates diabetic nephropathy in a model of type 2 diabetes [J].J Am Soc Nephrol，2018，29（4）：1108-1127.

[24]Huang JX，Manning BD.The TSC1-TSC2 complex：a molecular switchboard controlling cell growth[J].Biochem J，2008， 412（2）：179-190.

[25]Thakur S，Viswanadhapalli S，Kopp JB，et al.Activation of AMP-activated protein kinase prevents TGF-β1-induced epithelial-mesenchymal transition and myofibroblast activation[J].Am J Pathol，2015，185（8）：2168-2180.