芦荟活性提取物对腐败希瓦氏菌的抑制机理研究

余友恒 马堃 王艳奇

摘要 为了研究库拉索芦荟活性成分对腐败希瓦氏菌的抑制作用，采用琼脂打孔法，测定了在不同处理条件下的芦荟活性成分对腐败希瓦氏菌的抑菌活性。结果表明，芦荟中存在的活性成分能够有效抑制腐败希瓦氏菌的生长，其MIC为20%；抑菌效果在20～80 ℃范围内较为稳定，60 ℃处理后抑菌效果最佳；当pH值处于5～9时，抑菌圈直径在10.9～12.1 mm范围内，因而芦荟活性物能够稳定抑菌；通过微生物生长曲线以及其电导率的测定，进一步证明了芦荟活性提取物对腐败希瓦氏菌的生长有一定的抑制作用。

关键词 库拉索芦荟；活性提取物；腐败希瓦氏菌；琼脂打孔法；抑菌

中图分类号 R285.5 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）19-0265-02

Abstract In order to study the inhibitory effect of active compsonents of aloe vera against Shewanella putrefaciens，the inhibitory activity of active components of aloe against Shewanella putrefaciens was determined by agar perforation method.The results showed that the active components of aloe vera could effectively inhibit the growth of Shewanella putrefaciens，its MIC was 20%；the bacteriostatic effect was stable when the temperature was 20-80 ℃，and the best was at 60 ℃.The diameter of bacteriostatic circle was within 10.9-12.1 mm，when the pH value was 5-9，so the active components of aloe vera could stabilize the bacteriostatic activity.It was further proved that the active extracts of aloe vera had a certain inhibitory effect on the growth of Shewanella putrefaciens by the microorganism growth curve and the determination of conductivity.

Key words aloe vera；active extract；Shewanella putrefaciens；agar perforation method；bacteriostasis

蘆荟为多年生、常绿、多肉质草本植物。芦荟的种类繁多，其中库拉索芦荟、好望角芦荟、木立芦荟、开普芦荟被广泛应用于医学、美容与食用等领域[1]。本试验选用库拉索芦荟（Aloe barbadensis Miller）为试验材料。库拉索芦荟也称美国翠叶芦荟，其叶大肥厚、胶质丰富、品质优秀，是有益于药食应用的品种之一[2]。芦荟的主要成分为芦荟大黄素甙、异芦荟大黄素甙、芦荟甙等，而芦荟中的芦荟酊有着很强的抗菌性，不仅能杀灭真菌、霉菌、细菌、病毒，还能抑制、消灭病原体发育繁殖[3-5]。本试验以海产品中常见菌腐败希瓦氏菌为研究对象，测定了在不同pH值、温度处理条件下芦荟活性成分对腐败希瓦氏菌的抑制效果，再通过测绘加入芦荟汁的菌体生长曲线和电导率曲线来探索芦荟提取物作为抑菌剂在水产方面应用的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 供试材料与试剂。库拉索芦荟（购于大连市港西花卉城）；黄花鱼（用于腐败希瓦氏菌的提取，购于辽宁大连市场）；LB营养琼脂培养基和LB营养肉汤培养基；NaCl（AR级）、HCl（AR级）、NaOH（AR级）、无水乙醇（AR级）、助滤剂活性炭（AR级）、食品添加剂VC（AR级）。

1.1.2 仪器。试验仪器包括CJ-1680超净工作台、JA-2003型电子分析天平、恒温培养箱、立式压力蒸汽灭菌器、UV-2550紫外分光光度计、HH-6型数显恒温水浴锅、DDS-307A 型电导率仪、PHS-3C型酸度计、离心机、匀浆机、摇床以及实验室其他常规仪器。

1.2 试验方法

1.2.1 腐败希瓦氏菌的获取。获取流程：采样（腐败黄花鱼）→增殖培养→纯种分离→初筛→复筛→保存菌株（斜面保存）待用。

1.2.2 芦荟汁的准备。选取新鲜健康的库拉索芦荟叶片洗净→果肉烫热→匀浆→加入助滤剂活性炭（1 g/100 mL）→离心过滤（3 000 r/min，20 min）→加入食品添加剂VC→芦荟原汁→4 ℃低温保存备用[6-9]。

1.2.3 抑菌试验。采用牛津杯法[7]测定芦荟汁对腐败希瓦氏菌的抑制效果。取适量腐败希瓦氏菌接种于LB营养肉汤培养基中，过夜振摇培养（30 ℃，100 r/min），从中吸取50 ？滋L 接种于营养肉汤，在30 ℃、100 r/min的条件下振荡培养6 h，得到腐败希瓦氏菌。无菌条件下，将LB营养琼脂培养基倒入培养皿中，待冷却凝固后加入适量菌悬液，均匀涂布于培养基表面，30 ℃恒温培养15 min。用无菌镊子将直径为9 mm的牛津杯置于含菌培养皿中，每个培养皿中包含2个牛津杯，向牛津杯内加样150 ？滋L；其中以牛津杯加生理盐水为阴性对照（CK）。将培养皿置于30 ℃培养12 h，取出后测量并记录抑菌圈直径。

1.2.4 琼脂打孔法测定最低抑菌浓度（MIC）。灭菌培养基温度降低到60 ℃后，摇匀，快速倒入培养皿中，其中每个培养皿盛装培养基 15～20 mL。待冷却凝固后，加入适量菌悬液并均匀涂布于培养基表面，30 ℃条件下培养15 min。芦荟汁分别稀释为100%、80%、60%、40%、20%、10%以备用。用100 ？滋L灭菌的移液器枪头，在同一培养皿中间隔均匀地打3个孔，用无菌针头挑出琼脂孔中的培养基。各孔中心之间相距 ≥25 mm，与培养皿的周缘距离≥15 mm。分别吸取20 ？滋L不同浓度的芦荟汁加入琼脂孔内（3个孔为一组），以无菌水为空白对照。盖好培养皿，移入30 ℃培养箱，培养12 h后取出观察菌的生长情况并记录，3次重复。

1.2.5 热稳定性试验。取出适量浓度为100%的芦荟汁，分为5个等份。分别于20、40、60、80、100 ℃条件下恒温水浴处理20 min。以5种温度处理芦荟汁后，采用琼脂打孔法测抑菌圈直径，3次重复。

1.2.6 不同pH值对芦荟活性物抑菌效果的影响。取适量浓度为100%的芦荟汁6个等份。将NaOH（1 mol/L）和HCl（1 mol/L）分别调配成4～5、5～6、6～7、7～8、8～9与9～10等6个pH值区间，采用琼脂打孔法观测pH值对芦荟活性物抑菌活性的影响。3次重复，试验取平均值。

1.2.7 生长曲线的测定。取适量腐败希瓦氏菌，接种于LB营养肉汤培养基中，过夜振荡培养（30 ℃，100 r/min）。从此培养基中吸取菌液50 ？滋L，滴入新的LB营养肉汤于30 ℃、100 r/min振荡培养6 h，得到腐败希瓦氏菌悬液。取少量菌液过夜培养至对数期，加入适量芦荟汁溶液使其浓度为原液的20%作为试验组，同等条件下加入无菌水分作为对照组，摇床培养（30 ℃，100 r/min）。分别于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h取样，并在600 nm处测OD值。

1.2.8 菌液电导率的测定。取少量菌悬液培养至对数期的试验菌，加入适量芦荟汁原液（其浓度为原液浓度的20%）作为试验组，同等条件下加入无菌水分作为对照组，摇床培养（30 ℃，100 r/min）。分别于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h取样测其电导率，参考蓝蔚青等[10]的方法确定金属离子渗出的变化趋势。

2 结果与分析

2.1 抑菌试验

由表1可知，芦荟汁对腐败希瓦氏菌的生长存在抑制作用，其中加入芦荟汁原液的抑菌圈直径最大，可达10.2 mm。随着芦荟汁浓度降低，移取相同体积，其抑菌圈直径减小。当芦荟提取液浓度<20%时，芦荟汁对腐败希瓦氏菌无抑制效果，即MIC为20%。

2.2 热稳定性试验

如图1所示，芦荟原液在5种不同温度条件处理20 min后，抑菌效果在温度20～80 ℃范围内较为稳定；60 ℃的抑菌效果最佳；继续升高温度，芦荟提取液的活性迅速降低，故适宜温度范围是（60±20）℃。可见，温度对芦荟提取液的活性成分有影响，温度过高使抑菌活性受限。

2.3 不同pH值对芦荟活性物抑菌效果的影响

如图2所示，当pH值处于5～9时，抑菌圈直径在10.9～12.1 mm范围内；pH值为4.5时，抑菌圈直径达到最大，为19.6 mm。由此可见，芦荟活性物处于酸性环境下能更好地影响菌体的生长，但是不排除微酸环境本身对菌也有一定的抑制作用。

2.4 腐败希瓦氏菌生长曲线

采用比浊法测定腐败希瓦氏菌生长曲线。因为菌悬液的浓度与其吸光度值成正比，可利用分光光度计测得菌悬液的光密度（OD600值）与其对应的培养时间作图，即可绘制该菌在一定条件下的生长曲线。如图3所示，加入20%芦荟汁的试验组OD600值始终小于未加抑菌剂培养的对照组OD600值。从试验组来看，其在培养20 h后进入稳定期，而对照组在培养18 h后就进入稳定期。综上，芦荟汁的加入抑制腐败希瓦氏菌的生长，即芦荟提取液中活性成分对腐败希瓦氏菌有抑制作用。

2.5 菌液电导率

细胞膜的重要功能为选择透过物质，当细菌处于非自然生存环境时，细菌细胞膜会遭到破坏，流动性降低并且丧失选择透过性，细胞的保护膜被破坏导致内部电解质（如K+、Na2+）大量流出，使培养液的电导率发生改变。故通过菌液电导率的变化可反映细菌膜的受损情况。如图4所示，加入芦荟活性物的试验组的电导率明显高于对照组，因而可以推断芦荟活性物能破坏腐败希瓦氏菌菌体细胞膜，使电解质外渗，对菌体有抑制作用。

3 结论

试验探究了芦荟汁对腐败希瓦氏菌的抑制机制。结果表明，芦荟含有活性成分，能抑制腐败希瓦氏菌，其MIC为20%。芦荟原液在5种不同温度条件下处理20 min后，抑菌效果小幅度上升，抑菌效果受限值域为（60±20）℃。不同pH值处理后，芦荟提取物处于酸性环境下能更好地影响菌体生长，当pH值处于5～9时，抑菌圈直径在10.9～12.1 mm范围内，即芦荟提取物能够稳定抑制腐败希瓦氏菌；当pH值为4.5时抑菌效果最好，但不排除酸性环境对腐败希瓦氏菌的影响。

腐败希瓦氏菌生长曲线测定结果显示，加入20%芦荟汁的试验组OD600值始终小于未添加芦荟汁正常培养的对照组OD600值，就试验组来看，其在培养20 h后进入稳定期，而对照组在培养18 h后就进入稳定期；且加入芦荟汁的试验组电导率高于对照组，即芦荟提取物使腐败希瓦氏菌细胞膜被破坏、离子外渗，从而对菌体有抑制作用。综上，芦荟活性成分对腐败希瓦氏菌具有抑制作用，能够影响腐败希瓦氏菌菌体生长繁殖。

4 参考文献

[1] 侯冬岩，回瑞华，李铁纯.芦荟的研究进展[J].鞍山师范学院学报，2002（3）：54-59.

[2] 李云政，秦海元，王青华.国内外芦荟应用研究进展[J].化工进展，2000（2）：19-22.

[3] 邓阳勇，扈凤平.芦荟药理作用的研究进展[J].湖南中医学院学报，2004（6）：62-64.

[4] 何献君，张雪丹，吕光璞，等.芦荟抑菌作用的研究进展[J].实验技术与管理，2009，26（6）：215-217.

[5] 华春.库拉索芦荟的抑菌作用[J].南京师大学报（自然科学版），2004（1）：90-93.

[6] 姚晓敏，孙向军，黄时.芦荟及其抑菌作用的研究[J].食品科技，2001（4）：23-25.

[7] 刘冬梅，李理，杨晓泉，等.用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力[J].食品研究与开发，2006，27（3）：110-111.

[8] GARCASEGOVIA P，MOGNETTI C，ANDR？魪SBELLO A，et al.Osmotic dehydration of Aloe vera（Aloe barbadensis Miller）[J].Journal of Food Engineering，2010，97（2）：154-160.

[9] RODRGUEZ-GONZLEZ V M，FEMENIA A，GONZLEZ-LAREDO R F，et al.Effects of pasteurization on bioactive polysaccharide aceman-nan and cell wall polymers from Aloe barbadensis Miller[J].Carbohydrate Polymers，2011，86（4）：1675-1683.

[10] 藍蔚青，谢晶，侯伟峰，等.复合生物保鲜剂对腐败希瓦氏菌的抑菌机理[J].江苏农业学报，2012，28（1）：186-192.