NMDA受体NR2A、NR2B亚基在戊四氮诱导慢性癫痫大鼠中的作用

徐惠琴，杜延茹，沈晶赞，林嘉禾，丁思琦，郑荣远，王新施，王莉，叶朦倩

（温州医科大学附属第一医院 神经内科，浙江 温州 325015）

癫痫病（epilepsy）是危及人类健康的常见疾病，大脑皮层神经元过度同步放电是其发病的电生理基础[1-2]。N-甲基-D天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA）受体是哺乳动物神经系统中一种重要的兴奋性谷氨酸受体[3-5]。研究表明，谷氨酸大量蓄积时可以过度激活神经元膜上的NMDA受体，从而引起Ca2+内流，细胞内与Ca2+相关的信号通路过度激活，神经元异常放电；神经元异常高频放电导致神经环路异常激活及癫痫发作；反复的癫痫发作损伤神经元，导致神经元死亡[6-9]。在急性癫痫持续状态动物模型[10-11]和在离体海马神经元细胞实验[12]中分别发现选择性阻断NMDA受体NR2A亚基具有抗惊厥作用，而选择性阻断NR2B亚基则无上述作用，提示NR2A、NR2B亚基在癫痫发生过程中作用不同。但是在慢性癫痫模型中，关于NR2A、NR2B亚基作用的研究较少。因此，本研究通过构建戊四氮（pentetrazol，PTZ）诱导慢性癫痫大鼠模型并选择性阻断NR2A、NR2B亚基，探究其在慢性癫痫中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和分组：48只清洁级雄性SD大鼠，体质量180～200 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物许可证号：SCXK（沪）2017-0005。大鼠在室温（23±1）℃，湿度50%±5%，自然光照，昼夜节律，自由摄食饮水条件下适应性饲养4 d后随机分为5组：Control组8只，PTZ组、PTZ+MK-801（NMDA非选择性受体拮抗剂）组、PTZ+NVP（选择性NR2A亚基拮抗剂）组、PTZ+Ifenprodil（选择性NR2B亚基拮抗剂）组各10只。

1.1.2 主要药物和试剂：PTZ和MK-801购于美国Sigma公司，NVP-AAM077（NVP）和Ifenprodil购于美国MCE公司，DMSO购于上海翊圣生物科技有限公司。PTZ、MK-801、NVP均用0.9%氯化钠溶液配制；Ifenprodil先溶于DMSO，分装后-20 ℃保存，使用时用0.9%氯化钠溶液稀释。一抗R2A、R2B购于英国Abcam生物公司，二抗兔IgG-免疫组织化学试剂盒SABC即用型和DAB显色液购于北京博士德生物公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购于上海碧云天生物技术研究所，尼氏染色液购于北京索莱宝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 慢性癫痫模型：连续腹腔注射35 mg/kg PTZ共28 d构建慢性癫痫大鼠模型。注射PTZ 0.5 h前，Control组、PTZ+MK-801组、PTZ+NVP组、PTZ+Ifenprodil组分别注射等剂量0.9%氯化钠溶液、0.1 mg/（kg·d） MK-801、5.0 mg/（kg·d） NVP、10 mg/（kg·d） Ifenprodil。

1.2.2 行为学观察记录：在PTZ注射后1 h内按照Racine分级标准每天记录惊厥发作评分。分级标准：0级，无运动性癫痫发作活动；1级，节律性嘴和面部抽动；2级，点头或甩尾；3级，单肢抽动；4级，多肢抽动或强直；5级，全面性强直阵挛发作；6级，死亡。连续3 d出现4级及以上发作视为完全点燃。

1.2.3 石蜡切片制备：于第29天用5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，经心脏先后灌注0.9%氯化钠溶液、4%多聚甲醛后取脑组织于4%多聚甲醛固定6 h，脱水、透明、浸蜡、包埋。冠状位连续海马切片，切片厚度为4 μm。

1.2.4 尼氏染色观察大鼠海马神经元：切片常规脱蜡至水后将切片浸入Cresyl violet Stain，并将染缸于56 ℃恒温箱1 h，去离子水冲洗后置于Nissl Differentiation中分化2 min，脱水，二甲苯透明2次，每次3 min，中性树胶封片。每只大鼠随机选择2张切片在显微镜下观察。于4倍镜下观察各组大鼠海马整体形态，于400倍镜下对各组大鼠海马CA1区、CA3区、DG区相同部位进行神经元计数。

1.2.5 Western blot法测定大鼠海马NR2A、NR2B亚基水平：第29天用5%水合氯醛腹腔注射将大鼠麻醉处死，取新鲜海马组织于-80 ℃冰箱中保存。剪取50 mg左右的组织，加入300 μL的裂解液，置于冰上用剪刀剪碎，置于冰上裂解30 min，每隔10 min震荡混匀，4 ℃，13 000 r/min离心10 min，取上清分装于1.5 mL离心管中并置于-80 ℃保存，Western blot检测前采用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定及蛋白变性处理（100 ℃沸水浴煮蛋白5 min），采用12%分离胶和5%浓缩胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔蛋白上样量为20 μg，电泳结束后依次进行转膜，封闭，4 ℃一抗孵育过夜，洗膜3次，室温孵育二抗2 h，洗膜3次，ECL化学发光显影和TIF格式导出后在Image J软件下分析各条带光密度。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS21.0软件进行统计分析，并用GraphPad Prism7.0软件作图。所有数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 点燃情况及行为学评分 所有PTZ注射大鼠在15 d后达到完全点燃状态，各组点燃情况见表1。与PTZ组比，PTZ+MK-801组、PTZ+NVP组每日平均发作评分明显降低，MK-801和NVP可以减轻PTZ诱导慢性癫痫大鼠的惊厥发作强度，而Ifenprodil无此作用，见图1。

表1 各组大鼠点燃情况

2.2 各组大鼠海马神经元丢失情况 切片经尼式染色，4倍镜下，各组大鼠海马整体形态都存在。400倍镜下，对海马分区进行神经元计数结果如下：与Control组比，PTZ组、PTZ+MK-801组、PTZ+NVP组和PTZ+Ifenprodil组海马CA1区、CA3区、DG区神经元都有不同程度的丢失；与Control组比，PTZ组海马神经元大量丢失（CA1区：P＜0.05；CA3区：P＜0.01；DG区：P＜0.01），差异有统计学意义。相较PTZ组，MK-801、NVP和Ifenprodil均能减少海马神经元丢失；其中，MK-801、NVP减轻神经元损伤效果显著，以CA1区（P＜0.05）和DG区（P＜0.05）最明显；而Ifenprodil作用不显著，差异无统计学意义（各区P＞0.05）。见图2。

图1 各组大鼠行为学评分比较

图2 尼氏染色海马神经元丢失情况

2.3 Western blot检测海马NR2A、NR2B亚基水平与Control组比，PTZ组海马NR2A、NR2B亚基水平均下降（P＜0.05）。NR2A亚基水平，PTZ+NVP组高于PTZ组（P＜0.01），PTZ+MK-801组、PTZ+Ifenprodil组与PTZ组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。NR2B亚基水平，PTZ+MK-801组、PTZ+NVP组和PTZ+Ifenprodil组均高于PTZ组（P＜0.05）。见图3。

图3 Western blot检测各组海马NR2A、NR2B亚基水平

3 讨论

癫痫的发病机制复杂，目前主要认为是由于中枢性神经系统的兴奋性与抑制性失衡所致，而其与神经递质失衡、离子通道、神经胶质细胞、遗传及免疫的异常有密切关系[13]。其中，谷氨酸与γ-氨基丁酸分别是中枢神经系统中最重要的兴奋性神经递质与抑制性神经递质，并与癫痫发作密切关系[14-15]。PTZ是作用于脑干的中枢兴奋药，属于一种γ-氨基丁酸受体拮抗剂，一次大剂量腹腔注射可引起较大强度的惊厥发作，但动物并不发展为癫痫，只有在长期反复阈下剂量刺激致多次癫痫持续状态（status epilepticus，SE）后才发展为癫痫（慢性点燃，kindling）[16]。因此，可以通过反复注射阈下剂量的PTZ建立与人类癫痫病相似的慢性癫痫模型。

近几年的研究表明，NMDA受体参与体内许多生理和病理过程，其过度激活引起的谷氨酸兴奋性毒性是导致某些神经系统疾病的病因，比如癫痫、脑缺血以及创伤性脑损伤等[17-18]。在中枢神经系统中，NMDA受体是由4个亚单位围绕成的离子通道型受体，主要由基本亚单位NRl与调节型亚单位NR2组成[3]。NR2决定NMDA受体的特性，对受体的组装、表达、转运和突触的靶位点都起重要作用，分为NR2A、NR2B、NR2C、NR2D四种，不同的亚单位在大脑中的分布以及在生理和病理情况下的作用是不同的[3-4]。在成年大鼠海马中分布的调节亚单位主要是NR2A和NR2B[19]。CHEN等[10]的研究发现NR2A亚单位特异性地参与脑损伤导致的颞叶癫痫病，该结论在急性癫痫持续状态动物模型中得到验证。在慢性癫痫模型中尚未进行NR2A、NR2B亚基作用的探索。

在本研究中，我们通过连续28 d腹腔注射35 mg/kg PTZ构建PTZ诱导慢性癫痫大鼠模型并给予不同的NMDA受体拮抗剂（非选择性NMDA受体拮抗剂MK-801、选择性NR2A亚基拮抗剂NVP及选择性NR2B亚基拮抗剂Ifenprodil）来探究NMDA受体NR2A、NR2B亚基在慢性癫痫中的作用，发现PTZ可引起大鼠惊厥发作和海马神经元大量丢失；给予MK-801和NVP可以减轻大鼠惊厥发作强度，这种作用从用药2周后开始显现并持续存在，而给予Ifenprodil不能减轻惊厥发作；MK-801、NVP和Ifenprodil均能减少海马神经元丢失。这提示惊厥发作可能与NR2A亚基有关，而神经元损伤可能与NR2A、NR2B亚基均有关。

我们的研究结果与CHEN等[10]的结果一致。在匹罗卡品癫痫模型中，他们发现NR2A亚单位与癫痫的生成相关，NR2A和NR2B亚单位都与癫痫诱导的细胞死亡相关。他们还发现NR2A和NR2B亚单位在癫痫病生成中所起不同作用的原因是NR2A和NR2B亚单位与不同的信号通路相关，即选择性抑制NMDA受体的NR2A亚单位能降低BDNF mRNA的表达，选择性抑制NMDA受体的NR2B亚单位能降低ERK1/2磷酸化。

本研究采用尼式染色评估神经元损伤程度。尼氏染色方法是德国病理学家Nissl于1892年创立，其主要根据是神经元胞体内含有大量嗜碱性的尼氏小体。在神经元受损时，尼氏体的数量可减少甚至消失，因此根据形状大小和数量差异，可判别神经损伤程度[20]。我们在400倍镜下计数神经元来比较各组海马不同区域的神经元丢失情况。与PTZ组比，MK-801、NVP和Ifenprodil均能减少海马神经元丢失，提示神经元损伤可能与NR2A、NR2B亚基均有关。海马分区比较：CA1区神经元丢失多于CA3区、DG区，这可能是因为CA1区对缺血损伤最不耐受[21]。

蛋白检测结果显示：与Control组比，PTZ组、PTZ+MK-801组、PTZ+NVP组和PTZ+Ifenprodil组海马NR2A、NR2B亚基水平均下降，该现象可能与神经元受损坏死后膜蛋白溶解有关[10，22]。

综上，临床上大部分癫痫病例均表现为长期反复发作的慢性癫痫，因而探索慢性癫痫的发病机制尤为重要。目前，在离体细胞实验和急性癫痫模型中均表明NR2A亚基介导了致惊厥作用，但NR2A亚基在慢性癫痫模型中的作用研究仍偏少。我们在慢性癫痫模型中探索NR2A、NR2B亚基与惊厥发作的关系，结果显示惊厥发作可能与NR2A亚基有关，该亚基可能成为抑制癫痫发作的靶点之一。但本研究尚未对NR2A亚基介导抗惊厥发作的机制进行探索，需要更深入的研究来阐明NR2A亚基与受Ca2+调控的信号通路的关系。