核磁共振波谱法测定片剂中盐酸巴马汀含量

徐 凯，魏永鸽，郝海军

(1.黄河科技学院 医学院，河南 郑州 450005；2.上海雷允上药业有限公司 技术中心，上海 201401；3.郑州铁路职业技术学院 医学技术与工程学院，河南 郑州 450052)

随着核磁共振仪性能的不断提高及傅立叶变换技术的应用，近年来核磁共振技术越来越多地应用于定量分析领域[1-3]。目前，核磁共振定量法(qNMR)在食品、药品、农药等领域日益得到关注。中国、美国、日本及英国等各国药典均收载了qNMR法。在药物研发过程中，qNMR法不仅可准确测定原料药、中间体及制剂中的药物含量，还可同时鉴别假冒、伪劣产品，在药品质量控制中发挥着重要作用[4-6]。

黄藤素即盐酸巴马汀，是从防己科植物黄藤FibrurearecisaPierre.的根茎中提取得到的一种季铵型生物碱，具有良好的清热解毒效果，临床上主要用于妇科炎症、肠炎、呼吸道及泌尿道感染等。黄藤素片的质量标准收载于《中国药典》2015年版一部[7]，该标准采用高效液相色谱法测定黄藤素片中的盐酸巴马汀含量，薄层色谱法进行鉴别、检定，但操作过程较为复杂，费时费力。近年来市场上出现黄藤素片假冒伪劣产品[8]，因此迫切需要建立一种简单、快速测定黄藤素片中盐酸巴马汀含量及鉴别假冒伪劣产品的分析方法。在前期研究的基础上[9]，本文首先采用NMR法(1H NMR、13C NMR和HSQC谱)对黄藤素片提取物进行定性鉴别，进一步采用qNMR法对提取物进行含量测定。将qNMR法用于黄藤素片的质量控制，可实现定量分析与定性鉴别同时进行，且操作简单，省时省力，为推广qNMR法应用于药品质量控制提供了经验，也为其他药品的质量控制提供了有价值的参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试药

Bruker AVANCE Ⅲ400型核磁共振仪(瑞士布鲁克公司)；分析天平(十万分之一天平，德国Sartorius公司)；PS-40A型超声仪(菏泽仪器仪表有限责任公司)；氘代甲醇(CD3OD，氘代度99.8%，美国Sigma-Aldrich公司)；黄藤素片(批号：20180216、20180422、20180717，云南植物药业有限公司)；盐酸巴马汀(批号：H-015-130626，含量>98%，成都瑞芬思生物科技有限公司)；马来酸对照品(含量为99.7%，批号：190015-201302，中国食品药品检定研究院)。

1.2 内标溶液的配制

精密称取马来酸10mg置于10mL容量瓶中，加入约7mL氘代甲醇超声3min后放至室温，用氘代甲醇定容至刻度，即得质量浓度为1.0g/L的马来酸内标溶液，密封备用。

1.3 样品溶液的配制

精密称取盐酸巴马汀对照品100mg，置于10mL容量瓶中，加入约7mL氘代甲醇超声3min后放至室温，用氘代甲醇定容至刻度，即得质量浓度为10g/L的对照品溶液。

取15片黄藤素片，于研钵中研磨成细粉。精密称取约5mg(以盐酸巴马汀计)置于5mL容量瓶中，加入内标溶液约4mL，超声5min后放置至室温，以马来酸内标溶液定容至刻度。过0.45μm微孔滤膜后转移至核磁管中，即得黄藤素片供试品溶液。

1.4 测试条件

采用zg30脉冲序列，恒温测定温度为300K，谱宽(SWH)为8012Hz，中心频率(O1)设为2503Hz，采集时间(AQ)为4.01s，弛豫时间(D1)为15s，样品扫描次数(NS) 为64次，空扫次数(DS)为2次。

1.5 含量计算方法

将测得的1H NMR进行相位校正，对定量峰和内标峰积分5次，求取平均值，按照下式计算盐酸巴马汀含量：Wu=WsAuEu/(AsEs)，式中：Wu为盐酸巴马汀的质量(mg)；Au为盐酸巴马汀的定量峰面积；As为马来酸内标的峰面积；Ws为马来酸内标的质量(mg)；Eu为盐酸巴马汀的质子当量(盐酸巴马汀相对分子质量与定量峰代表的质子数之比)；Es为马来酸的质子当量(马来酸相对分子质量与内标峰代表的质子数之比)。

图1 黄藤素片提取物的1H NMR(A)、13C NMR(B)与HSQC(C)图谱Fig.1 1H NMR(A),13C NMR(B)and HSQC(C) spectra of the extract of Huangtengsu tablet

2 结果与讨论

2.1 黄藤素片提取物的鉴别

取适量黄藤素片粉末加入氘代甲醇，超声后放至室温，测定其1H NMR、13C NMR和HSQC谱(图1)。1H NMR谱(图1A)显示22个质子[9]，包括低场区6个芳香质子，5位和6位的2个亚甲基质子，2、3、9、10位的4个甲氧基质子。13C NMR谱(图1B)显示21个碳信号，对应于结构中的21个碳原子。HSQC谱(图1C)显示12个相关点(见表1)，9个季碳无相关点。综上，1H NMR、13C NMR和HSQC谱的基本信息与盐酸巴马汀分子式(C21H22ClNO4)相符。

2.2 氘代溶剂与内标的选择

考察了氘代甲醇和氘代二甲基亚砜作为提取溶剂时对黄藤素片中盐酸巴马汀含量测定的影响。结果显示，以氘代二甲基亚砜为提取溶剂时，1H NMR的杂质成分较多，这可能是由于氘代二甲基亚砜溶解了片剂辅料所致[10]。另外，氘代二甲基亚砜样品溶液在冬季室温配制时极易凝固，需加热溶解后才可测定，而加热处理会导致溶液体积发生变化，对测定结果造成一定影响，且样品溶液粘度较高。而以氘代甲醇作为提取溶剂时，不仅无片剂辅料杂质成分干扰，且样品溶液状态不受季节影响，操作简单方便。综合考虑，最终选用氘代甲醇作为提取溶剂。

内标物一般选择易于识别且不干扰样品定量的尖锐单峰。本实验选择氘代甲醇为溶剂，马来酸为内标物质，混合物的1H NMR谱图见图2。马来酸溶剂峰在δ6.31处呈尖锐的单峰，与盐酸巴马汀的1H NMR峰不重叠，专属性较高。因此，选择马来酸作为内标物。由于盐酸巴马汀在δ7.07处为一尖锐、独立的单峰，附近无其他杂质干扰，因此选择该处信号作为定量峰。

2.3 方法学研究

前期对qNMR采集时间、弛豫时间和样品扫描次数等基本测试参数的研究[9]表明，当采集时间大于4.01s时可保证FID信号衰减完全，得到的1H NMR谱基底无震荡，因此确定采集时间为4.01s。当弛豫时间大于15s时，样品定量峰与内标峰的比值基本保持不变，为节约测试时间，确定弛豫时间为15s。同理，样品扫描次数确定为64次。另外，定量峰与内标峰的积分区域对测试结果影响也较大，本文选取峰形轮廓线与水平基线交叉处作为积分区域，测得待测物定量峰的积分区域为δ7.01～7.13，内标峰的积分区域为δ6.27～6.35。本实验在此条件下进行方法学研究。

2.3.1线性关系以“1.2”的内标溶液配制1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 g/L的盐酸巴马汀对照品系列溶液。以盐酸巴马汀与马来酸的定量峰面积之比(As/Ar)为横坐标(x)，盐酸巴马汀与马来酸的质量比(ms/mr)为纵坐标(y)进行线性回归，得回归方程为y=3.820 4x-0.092 2(r=0.999 3)，线性范围为1.00～10.00 g/L。

2.3.2仪器精密度取供试品溶液，按“1.4”条件连续测定6次，获取1H NMR并积分(5次积分结果取平均值)，计算盐酸巴马汀定量峰与内标峰面积的比值。结果显示，6次测定结果的相对标准偏差(RSD)为0.39%。

表1 黄藤素片提取物的结构解析Table 1 Structural analysis of the extract of Huangtengsu tablet

图2 黄藤素片提取物与马来酸混合物的1H NMR图谱Fig.2 1H NMR spectrum of the extract of Huangtengsu tablet and maleic acid mixture

2.3.3样品稳定性取同一份样品分别于0、2、4、8、12 h进行测定，获取1H NMR并积分(5次积分结果取平均值)，计算盐酸巴马汀定量峰与内标峰面积的比值。结果显示，5次测定结果的RSD为0.65%，因此样品溶液在12 h内基本稳定。

2.3.4重复性按照“1.3”方法平行配制6份样品溶液，获取1H NMR并积分(5次积分结果取平均值)，计算黄藤素片中盐酸巴马汀的含量。结果显示，6份样品测定结果的RSD为1.7%。因此，qNMR法测定结果的重复性良好。

2.3.5检出限与定量下限取对照品溶液逐步进行稀释，按照“1.4”测试条件分别进样测定，以盐酸巴马汀的峰高与基线波动高度比值作为信噪比(S/N)，以S/N为3时的盐酸巴马汀质量浓度作为检出限(LOD)，S/N为10时的盐酸巴马汀质量浓度作为定量下限(LOQ)[3-4]。得到所建立qNMR方法的LOD为8.5 mg/L，LOQ为25.0 mg/L。

2.3.6回收率试验按照“1.3”方法配制供试品溶液，分别加入低、中、高3个质量浓度的盐酸巴马汀对照品溶液，每个浓度平行配制3份，采用建立的qNMR法进行测试并计算回收率，结果见表2。3个加标水平下的回收率为98.5%～104%，RSD为1.4%～2.3%。

表2 片剂中盐酸巴马汀的回收率试验结果Table 2 Recoveries of hydrochloride palmatine in tablets

表 3 不同方法对片剂中盐酸巴马汀含量的测定结果Table 3 Determination result of hydrochloride palmatine in tablets by different methods

2.4 与高效液相色谱法测定结果的比较

参考《中国药典》2015年版一部的方法对黄藤素片中盐酸巴马汀的含量进行测定。结果显示(表3)，高效液相色谱法与核磁共振波谱法的测定含量较为接近。黄藤素片的标示量为100 mg/片，按照《中国药典》2015年版的要求，黄藤素片中盐酸巴马汀的含量应为标示量的90.0%～110%，因此两种测定方法的结果均符合《中国药典》要求。

3 结 论

本研究采用qNMR法测定了黄藤素片中盐酸巴马汀的含量，测定无需对照品和分离过程，样品配制过程简单，可有效减小样品前处理对测定结果的影响。建立的qNMR法同时实现了黄藤素片中盐酸巴马汀的定量分析与定性鉴别，且操作简单、快速、省时省力，测定结果与高效液相色谱法基本一致。由于qNMR法集定性鉴别与定量测定于一体，在药物质量控制包括有效成分鉴别、杂质检查及有效成分含量测定等中的应用将日益广泛，不仅有助于制药企业控制产品质量，也为我国打击假冒伪劣药品提供了一种非常有力的监测手段。