红豆杉属植物中紫杉烷类物质含量比较
2018-12-19姜艳沈晨佳周丹英余琪
姜艳，沈晨佳，周丹英，余琪*
(1.浙江省中药研究所有限公司，浙江 杭州 310023； 2.杭州师范大学，浙江 杭州 310018)
红豆杉又名紫杉、赤柏松，为国家一级保护树种。在我国，红豆杉主要有4种、1变种，分别为中国红豆杉、云南红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉、南方红豆杉。此外，还有20世纪末引种我国的杂交品种曼地亚红豆杉，其母本是东北红豆杉，父本是欧洲红豆杉[1]。
近年来，红豆杉因植株中含有高效抗癌成分紫杉醇等活性成分而倍受关注[2]。临床研究表明，红豆杉在抗肿瘤方面具有较高的应用价值[3]。目前，从红豆杉属植物中已分离得到400多种紫杉烷类化合物，并且不断有新的化合物被分离和鉴定[4-5]，大多数该类成分均显示出较强的抗癌活性[6-7]。除紫杉醇外，10-脱乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DAB)、巴卡亭Ⅲ、三尖杉宁碱和7-表-10-脱乙酰基紫杉醇(10-DAT)等也都是紫杉烷化合物，可作为紫杉烷类药物半合成和修饰的起始原料，在抗癌药物中得到了一定的应用。本文建立基于高效液相色谱(HPLC)检测红豆杉中上述5种紫杉烷类成分含量的方法，并对5种红豆杉(西藏红豆杉、云南红豆杉、南方红豆杉、东北红豆杉、曼地亚红豆杉)枝叶中的紫杉烷类成分含量进行对比研究，旨在为红豆杉种源选育及野生资源保护利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
西藏红豆杉(TaxuswallichianaZucc.)采自西藏墨脱县，云南红豆杉(TaxusyunnanensisCheng et L.K.Fu)采自云南德钦县，南方红豆杉[Taxuschinensis(Pilger) Rehd.var.mairei(Lemee et Levl.) Cheng et L.K.Fu)采自浙江德清县，东北红豆杉(TaxuscuspidataSieb.et Zucc.)采自吉林抚松县，曼地亚红豆杉(Taxus×media)采自安徽和县。各样品采摘时间均为夏季，经浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验室冯尚国实验师鉴定。
标准品：紫杉醇、10-DAB、10-DAT，购于阿拉丁，批号分别为1516034、1623007、LEAOP17；巴卡亭Ⅲ、三尖杉宁碱，购于四川成都曼斯特生物科技有限公司，批号分别为16090210、17022201。各标准品含量均在98%以上。
甲醇、乙腈为色谱纯，水为去离子水，其余试剂均为分析纯。
Aglient HP1200 高效液相色谱仪，二极管阵列检测器(DAD)。
1.2 色谱条件
1.2.1 10-DAB、10-DAT、巴卡亭Ⅲ、三尖杉宁碱
色谱柱：迪马C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：35 ℃；进样量：20 μL；理论塔板数按标准品计算，不低于8 000；检测波长：227 nm；流速：0.8 mL·min-1。流动相A，乙腈；流动相B，水。采用梯度洗脱，分时流动相体积比(A∶B)：0～10 min，20∶80；10～30 min，33∶67；30～40 min，45∶55；40～60 min，50∶50；60～61 min，43∶57；61～75 min，43∶57。
1.2.2 紫杉醇
色谱柱：迪马C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：40 ℃；进样量：20 μL；理论塔板数按标准品计算，不低于8 000；检测波长：227 nm；流速：0.6 mL·min-1。流动相A，甲醇；流动相B，乙腈；流动相C，水。流动相体积比A∶B∶C为0～30 min 21∶42∶37。
1.3 溶液配制
1.3.1 标准品溶液
分别称取10-DAB、10-DAT、巴卡亭Ⅲ、三尖杉宁碱、紫杉醇标准品适量，加甲醇，制备成浓度分别为21.26、9.00、13.40、28.50、21.64 μg·mL-1的标准品溶液。
1.3.2 供试样品溶液
取供试样品粉末(过3号筛)约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇超声处理(功率300 W，频率50 kHz，40 ℃以下)3次(每次加液量分别为50、30、20 mL)，每次30 min，过滤，合并滤液，减压蒸干，残渣以45 mL水-二氯甲烷(体积比1∶2)溶液分次溶解，转移至分液漏斗中，分取二氯甲烷，水层加二氯甲烷振摇提取3次，每次20 mL，合并二氯甲烷液，40 ℃以下减压蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
1.4 检测方法学考查
1.4.1 被测成分的线性关系和线性范围
精密吸取各标准品溶液2～20 μL，按1.2节色谱条件测定峰面积，分别以峰面积为因变量(y)，标准品进样量为自变量(x)，绘制标准曲线，拟合回归方程。
1.4.2 精密度实验
精密吸取各标准品溶液，重复进样6次，每次10 μL，考查测定方法的精密度。
1.4.3 稳定性实验
取同一标准品溶液，室温下放置，分别在0、1、4、6、12、24 h进样10 μL测定，检测样品稳定性。
1.4.4 重复性实验
取同一批红豆杉样品6份，依前述实验条件测定10-DAB、10-DAT、巴卡亭Ⅲ、三尖杉宁碱、紫杉醇含量，检测方法的重复性。
1.4.5 加标回收率实验
取已知含量的红豆杉样品，分别添加10-DAB、10-DAT、巴卡亭Ⅲ、三尖杉宁碱、紫杉醇标准品适量，同前述条件，进行测定。
2 结果与分析
2.1 方法检测性能
2.1.1 标准品与样品的色谱图
5种紫杉烷类化合物标准品和样品的色谱图如图1所示。可以看出，本文方法下各供试紫杉烷类化合物出峰良好，适用于样品检测。
2.1.2 被测成分的线性关系和线性范围
如表1所示，在本实验条件下，以进样量10 μL计算，10-DAB、巴卡亭Ⅲ、10-DAT、三尖杉宁碱、紫杉醇分别在4.25～25.51、5.36～16.08、5.40～14.40、11.40～34.20、4.33～25.97 μg·mL-1内线性良好，决定系数(R2)均在0.999以上。
表1 被测成分线性关系和线性范围
1，10-DAB；2，10-DAT；3，巴卡亭Ⅲ；4，三尖杉宁碱；5，紫杉醇。a、c，标准品；b、d，样品图1 标准品与样品的色谱图
2.1.3 检测方法的精密度
精密度实验结果显示，各标准品峰面积相对标准偏差：10-DAB为0.2%，巴卡亭Ⅲ为0.5%，10-DAT为0.6%，三尖杉宁碱为2.3%，紫杉醇为0.4%，表明仪器精密度良好。
2.1.4 检测方法的稳定性
稳定性实验结果显示，各标准品相对标准偏差：10-DAB为1.4%，巴卡亭Ⅲ为0.3%，10-DAT为0.4%，三尖杉宁碱为0.7%，紫杉醇为1.4%，表明仪器精密度良好，标准品溶液在室温下比较稳定。
2.1.5 检测方法的重复性
重复性实验结果显示，各成分含量相对标准偏差：10-DAB为4.4%，巴卡亭Ⅲ为3.0%，10-DAT为1.8%，三尖杉宁碱为3.7%，紫杉醇为1.3%，表明本方法的重复性较好。
2.1.6 加标回收率
加标回收率实验结果显示，10-DAB、巴卡亭Ⅲ、10-DAT、三尖杉宁碱、紫杉醇的加标回收率分别为98.9%、93.3%、96.2%、91.4%、99.7%，相对标准偏差分别为1.0%、1.4%、2.1%、2.4%、0.9%。
综合上述各项指标可知，本文方法符合相关检测要求，可用于检测红豆杉中5种紫杉烷类化合物的含量。
2.2 红豆杉中紫杉烷类化合物含量对比
5种红豆杉属植物枝叶中紫杉烷类成分的含量见表2。不同种红豆杉中紫杉烷类化合物含量有较大差异。紫杉醇含量以东北红豆杉最高，曼地亚红豆杉次之，且二者的含量远高于其他品种，是含量最低的西藏红豆杉的10余倍。10-DAB含量曼地亚红豆杉最低，不至其他品种的一半，其他品种含量相近。巴卡亭Ⅲ含量差异较大，以云南红豆杉含量最高，东北红豆杉略低，二者的含量远高于其他品种。三尖杉宁碱含量以东北红豆杉最高，曼地亚红豆杉次之，其他品种含量较低。10-DAT含量普遍较低，最高的为东北红豆杉，最低的为西藏红豆杉。5种紫杉烷类化合物总含量以东北红豆杉最高，曼地亚红豆杉、云南红豆杉和南方红豆杉含量相近，西藏红豆杉最低。
表2 不同品种红豆杉枝叶中紫杉烷类
综合各成分来看，东北红豆杉最具开发利用价值，曼地亚红豆杉作为我国20世纪末引种的杂交品种，其紫杉醇含量相对较高，也具有较高的开发利用价值。
3 小结
本文建立起5种紫杉烷类化合物的含量检测方法，并对西藏红豆杉、云南红豆杉、南方红豆杉、东北红豆杉、曼地亚红豆杉中5种紫杉烷类化合物含量进行测定。结果表明，紫杉醇和三尖杉宁碱含量以东北红豆杉最高，曼地亚红豆杉次之；10-DAB含量以曼地亚红豆杉最低，不到其他品种的一半；巴卡亭Ⅲ含量以云南红豆杉最高，东北红豆杉略低；10-DAT含量普遍较低。5种紫杉烷类化合物总含量以东北红豆杉最高，曼地亚红豆杉、云南红豆杉和南方红豆杉含量相近，西藏红豆杉最低。综合来看，东北红豆杉和曼地亚红豆杉较具开发利用价值。
