河鲈细菌性肠炎致病菌的分离、鉴定及药敏实验*

杨昆明 郭爱民 马江霞 段成任 谢志胜 岳 城



河鲈细菌性肠炎致病菌的分离、鉴定及药敏实验*

杨昆明 郭爱民 马江霞 段成任 谢志胜 岳 城①

(新疆农业大学动物医学学院 乌鲁木齐 830052)

河鲈(Linnaeus)是新疆额尔齐斯河特有的土著鱼类，已开展人工养殖，但其病害相关研究较少。2016年，五家渠某水产推广站河鲈突然大批死亡，作者从发病的河鲈肝脏和肠道分离病原菌，对分离菌进行了传代纯化培养。结果显示，在20℃培养24 h后，ZL1能形成边缘整齐、中间微隆起、表面光滑、浅黄色、有特殊芳香气味、大小为1.5~2 mm的菌落，在血琼脂平板上能形成明显的β-溶血圈；ZL3和ZL5可形成圆形、微隆起、表面湿润光滑、灰白色、半透明、菌落大小为0.5~ 1 mm的菌落，但在血琼脂平板上不能形成溶血圈。经革兰氏染色、生理生化、16S rRNA序列比对和基因序列进化树分析，鉴定ZL1株为温和气单胞菌()，ZL3和ZL5株为迟缓爱德华菌()。药敏实验结果显示，ZL1株对庆大霉素、米诺环素、头孢他啶等药物高度敏感，对链霉素、青霉素、克拉霉素等耐药；ZL3和ZL5株对左氧氟沙星、链霉素和恩诺沙星敏感，对庆大霉素、氨苄西林、青霉素、复方新诺明等药物耐药。人工感染结果显示，分离菌均具有明显致病性。

河鲈；温和气单胞菌；迟缓爱德华菌；鉴定；药敏实验

河鲈(Linnaeus)，地方名为五道黑，属于鲈形目(Perciformes)、鲈科(Percidae)、鲈属()，是肉食性凶猛鱼类，广泛分布于欧洲、亚洲北部和美洲北部，在我国仅产于新疆的额尔齐斯河和乌伦古湖水域(唐富江等, 2009)，是新疆额尔齐斯河重要的土著经济鱼类之一(任慕莲等, 2002)，有生长速度快、抗病能力强等特点，其肉质鲜美，市场需求十分紧俏(唐富江等, 2008)。近年来，由于过度捕捞和环境因素的影响，河鲈野生资源量大幅下降，目前已开展人工养殖。2016年5月，新疆五家渠某池塘人工养殖河鲈出现食饵量下降、精神萎靡、对外界刺激反应不灵敏、时而侧游的现象，病鱼有肛门红肿、腹部膨大、体表鳞片脱落、烂尾烂鳃等症状，发病水温高(25℃)，每个池子死亡数达250~350尾/d，造成巨大的经济损失。通过临床剖检、寄生虫学、细菌学、病理学等方法进行了诊断，在体表发现有锚头鳋()，但寄生数量不多，不是造成河鲈死亡的首要因素，在排除了寄生虫感染和病毒感染造成死亡的情况下，怀疑是细菌感染所致。剖检病鱼内脏，进行细菌分离纯化，通过革兰氏染色、生理生化实验、药物敏感性实验、分子生物学实验对分离菌进行了初步鉴定，在此基础上通过测序对细菌16S rRNA基因序列进行分析，并构建进化树，以探讨分离菌在所属菌群中的分类位置。本研究旨在丰富河鲈细菌病病原研究资料，并为河鲈细菌病的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂

来自新疆五家渠某养殖场的患病河鲈16尾，病鱼有鳞片脱落、腹部膨胀、肛门红肿外突的症状。体长约为15~28 cm，体重约为170~300 g，用于临床剖检、病料采集和病原菌分离。剖检时，已有部分鱼翻肚、死亡。实验用河鲈为该场未发病同批次鱼池，体长约为12~22 cm，体重约为145~250 g，在实验室暂养3周，确定健康无病后，用于回归感染实验。

LB肉汤、LB琼脂、M-H培养基购自青岛日水生物技术有限公司；细菌微量生化实验管、革兰氏染液、药敏纸片购自杭州天河微生物试剂有限公司；细菌16S rRNA通用引物、序列测定由生工生物工程(上海)股份有限公司提供；胶回收试剂盒购自OMEGA生物科技有限公司；质粒提取试剂盒购自全式金生物科技有限公司。

1.2 剖检观察

肉眼检查病鱼体表有无甲壳类寄生虫，同时，分别刮取鳃丝粘液和体表粘液，在体视显微镜下观察粘液中有无寄生虫(赵江山等, 2011)。依次检查鱼头、腹、鳍、肛门有无病变；剖开腹部，检查有无腹腔液，肝脏、胆囊、脾脏和肾脏等器官质地、形态，有无出血，肠壁弹性及肠道内容物。

1.3 细菌分离培养

无菌条件下，采集病鱼腹腔液、肝脏、脾脏、肠和肾脏。腹腔液用接菌环蘸取，在LB琼脂培养基上划线；内脏用灭菌手术剪剪开，用横断面在LB琼脂培养基上涂抹，再持接菌环在涂抹处划线，20℃倒置培养16~24 h。挑取形态一致的单个优势菌落，进行分离传代纯化培养。

1.4 细菌鉴定

挑取琼脂平板上单菌落，经稀释、涂片、固定和染色后，显微镜油镜下观察菌体形态和颜色，镜下观察菌体单一后，挑取单个菌落接种于Mueeller- Hinton(M-H)液体培养基，置于20℃恒温摇床，培养24 h，用培养的菌液进行V-P、H2S等生理生化实验，实验结果参照房海等(2014)进行分析。

分离纯化的细菌接种于LB液体培养基中，于 20℃恒温摇床培养24 h后，用30%甘油与菌液6∶4加到EP管中混匀封口，作为菌种保存。以菌液为底物，进行菌液PCR。选用细菌通用引物扩增16S rRNA(正向引物27F: 5¢-AGAGTTTGATCCTGC-3¢；反向引物1492R: 5¢-GGTTACCTTGTTACGACTT-3¢)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反应体系(25 μl)：Super mix 12.5 μl，上游引物1 μl，下游引物 1 μl，底物2 μl，ddH2O 8.5 μl。PCR反应条件：94℃预变性4 min；94℃变性40 s，54℃退火60 s，72℃延伸2 min，共35个循环；72℃再延伸10 min。

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，连接转化并提取质粒，质粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果在NCBI上Blast比对，用MEGA6.0软件对序列进行多重比较，并构建系统发育树。

1.5 致病菌药敏实验

吸取100 μl M-H液体培养基培养的菌液，均匀涂布于M-H琼脂培养基表面，用烧灼后的无菌镊子夹取药敏片，以适当间隔粘贴于琼脂培养基表面，并轻压药敏片，使之与培养基充分接触。正置0.5 h，然后，倒置于20℃恒温培养箱，培养16~24 h后，观察并测量抑菌圈直径，根据抑菌圈的大小来判断该菌对相应药物的敏感程度(尚红等, 2015)。

1.6 病理组织切片

将健康鱼和患病鱼的肝脏和肠体完整切下并保存在4%甲醛中，按照病理组织切片法(李钰等, 2014)，采用LEICA RM2235手摇连续切片机进行石蜡组织切片，并对切片进行染色，镜下对比病变内脏切片与健康内脏切片间组织的变化。

1.7 回感实验

实验设3个浓度组，每个浓度组2个梯度浓度，高浓度组：1×109、1×108CFU/ml；中浓度组：1×107、1×106CFU/ml；低浓度组：1×105、1× 104CFU/ml。测定3个目标菌液在OD600 nm下的吸光值，用无菌生理盐水调至相同后，再稀释成相应浓度的细菌悬浊液。每尾腹部肌肉注射0.1 ml，对照组注射等量的无菌生理盐水，每组注射10尾，保持水温为20℃，不间断供氧，连续观察7 d，每天定时投喂，观察并记录实验鱼的症状及每天死亡数目，死鱼及时捞出并剖检，检查其体表及内脏器官的病变情况并做记录，同时，进行细菌分离。参考累积法(Reed-Muench)计算半数致死量(LD50)。

2 结果与分析

2.1 体表检查及病理剖检结果

在鱼背鳍基部和腹部发现锚头鳋，剥落之后，鳞片基部有出血，鱼腹部膨胀，肛门红肿外突，严重者轻压腹部可见淡黄色液体从肛门流出。剖开腹部，有腹水；肝脏肿大，出血不明显；肠壁淤血严重，肠道内几乎没有食物，整个肠道有大量胶胨状黄色黏液，肠壁变薄且无弹性。

2.2 致病菌形态特征

从患病鱼肝脏、肠道分离得到优势菌，革兰氏染色均为阴性短杆菌，无荚膜，也不形成芽孢，菌体成对或单独存在，有时可见首尾相连，形成有弧度的长链状菌体，但是，调节细准焦螺旋可见是由几个单独的短杆菌形成；在LB琼脂培养基上，ZL1可形成边缘整齐、微隆起、表面光滑、浅黄色、有特殊芳香气味、菌落大小为1.5~2 mm (20℃, 24 h)的菌落，且在血琼脂平板上能形成明显的β-溶血圈；ZL3和ZL5可形成圆形、微隆起、表面光滑且湿润、灰白色、半透明、菌落大小为0.5~1 mm (20℃, 24 h)的菌落，在血琼脂平板上不能形成溶血圈。

2.3 生理生化结果

生理生化反应显示，ZL1株产酸不产气，能利用V-P、蔗糖、葡萄糖、明胶、枸橼酸(Simmons)；在含5% (/) NaCl的培养基中能生长，高于6%不生长；不利用果糖、水杨苷、纤维二糖、H2S、酒石酸、阿拉伯糖。ZL3、ZL5株产酸、产气，能利用葡萄糖、硫化氢；在含4% NaCl的培养基中能生长，高于5%不生长；V-P、明胶、枸橼酸反应阴性；不利用蔗糖、果糖、水杨苷、纤维二糖、阿拉伯糖、酒石酸(表1)。

2.4 PCR鉴定及系统发育树构建

对分离菌16S rRNA进行PCR扩增，通过1%琼脂糖凝胶电泳可见，片段长度约为1600 bp。把测序反馈序列上传NCBI进行基因序列比对，结果显示，ZL1株为温和气单胞菌，ZL3、ZL5 2株菌为迟缓爱德华氏菌。将3株菌序列在EzBioCloud上同时进行比对，结果与NCBI比对结果相同，其中，ZL1株的相似率为99.78%，ZL3的相似率为99.17%，ZL5的相似率为99.31%。初步修饰后将序列上传NCBI并获得3个序列号(MF767618、MF980985和MF992220)。选择8个气单胞菌属标准参考株，运用Mega 6.0建立系统发育树，以为外类群，所做进化树显示，ZL1与上海株KX692881聚为1支，置信度为88 (图1)。

表1 分离菌的生理生化特性

Tab.1 Physiological-biochemical characteristics of isolated bacteria

+：阳性；–：阴性；±：生长缓慢。*：参考文献(房海等, 2010)

+: Positive; –: Negative; ±: Slow growth. *: Reference (Fang,, 2010)

选择12个爱德华氏菌属标准参考株，以维氏气单胞菌(KY767542)为外类群，所做进化树显示，ZL3与四川株KF872771聚为1支，置信度为67；ZL5与广州株JX393017聚为1支，置信度为72 (图2)。

图1 基于分离菌株ZL1 16S rRNA基因与同源性菌株相应基因构建的系统发育树

图2 基于分离菌株ZL3和ZL5 16S rRNA基因与同源性菌株相应基因构建的系统发育树

2.5 药敏实验结果

用21种水产常用药进行药敏实验，药敏实验判定结果参照美国临床实验室标准化委员会VET01-A4标准(表2)。结果显示，ZL1株对庆大霉素、米诺环素、头孢他啶等药物高度敏感；对链霉素、青霉素、克拉霉素、哌拉西林、卡那霉素等耐药。ZL3株对恩诺沙星、左氧氟沙星、链霉素敏感；对庆大霉素、青霉素、复方新诺明等药物耐药。ZL5株对左氧氟沙星、链霉素、恩诺沙星敏感；对庆大霉素、氨苄西林、青霉素、复方新诺明等药物耐药。

2.6 病理组织切片

正常肠道由内向外分为粘膜、粘膜下层、肌层和外层，其中，粘膜和粘膜下层向肠道内突出形成褶皱状的肠绒毛。通过病理组织切片染色，可观察到病鱼肠粘膜变性坏死(图3A)，肠道细胞呈凝固性坏死 (图3B)。正常肝脏细胞呈多边形，边缘整齐，细胞核在中间(图3D)；而病鱼肝脏炎性细胞浸润，脂肪空泡变性(图3C)。

表2 病原菌的药敏实验结果

Tab.2 Results of antibiotic sensitivity test of strain pathogenic bacteria

注：R：耐药；I：中度耐药；S：敏感

Note: R: Resistant; I: Intermediately resistant; S: Sensitive

2.7 致病菌回感实验

为了探究主要致病菌，进行分组人工回感实验。腹部肌肉注射ZL1 6 h后，可见高浓度组游动缓慢；12 h后，高浓度组开始出现翻肚的现象，且腹部注射处皮肤红肿；18 h后，开始有死亡现象；96 h后，高浓度Ⅱ组全部死亡；8 d内高浓度组全部死亡。

人工腹部肌肉注射ZL3、ZL5后，首日高浓度组可见死亡，ZL5低浓度组也出现死亡，怀疑是注射时鱼体的应激所造成。实验鱼注射12 h后，高浓度组出现翻肚侧游现象，且腹部注射处皮肤红肿；18 h后，ZL5组死亡4尾，ZL3组死亡2尾；96 h后，ZL5高浓度Ⅱ组全部死亡；7 d内ZL5高浓度组全部死亡；15 d内ZL3高浓度组全部死亡。

将ZL1、ZL3和ZL5等浓度混匀，人工腹部肌肉注射0.1 ml，正常饲养3 h后，高浓度组和中浓度组出现侧游情况；6 h后，有鱼死亡；48 h后，高浓度几乎全部死亡；中浓度Ⅱ组在5 d全部死亡。

实验期间，高浓度组在注射菌液后正常投喂期间，进食量明显低于低浓度组；发病时间短于低浓度组；注菌各组发病症状相似，从各组死亡与濒临死亡的实验鱼肝脏、肠道等处分离得到与ZL1、ZL3、ZL5的形态、生理生化特征相一致的细菌。ZL1、ZL3和ZL5的LD50依次分别为8.91×105、4.47×104和1.12×104CFU/ml，混合组的LD50为0.32×104CFU/ml。对照组饮食正常，没有死亡。结果显示，分离菌都具有致病性，其中，迟缓爱德华菌(ZL3和ZL5)的致病力更强(表3)。

3 讨论

3.1 温和气单胞菌和迟缓爱德华菌对水产业的危害

图3 病理组织切片

A：病变肠道纵切面；B：肠粘膜变性坏死；C：肝脏炎性细胞浸润、脂肪空泡变性；D：正常肝脏

A: Infected intestinal longitudinal section; B: Intestinal mucosal degeneration and necrosis; C: Liver inflammatory cells infiltration, hepatic fatty vacuolar degeneration; D: Normal liver

迟缓爱德华菌能引起人的脑膜炎、腹膜炎、败血症、软组织感染、肠道疾病，在热带和亚热带最为常见(Schlenker, 2009)，中国台湾报道的22例肠道感染病例中，死亡率为23%，因此，提出将此菌作为肠道感染常规检查内容，以腹泻病病原菌高度重视(Wang, 2005)。崔新凤等(2006)临床报道称，该菌也可造成肝脓肿。

3.2 分离菌药敏结果分析及中药防控优势

通过以上药敏实验，可见温和气单胞菌对链霉素、青霉素、克拉霉素、哌拉西林、卡那霉素等药耐受，对水产常用药氟苯尼考、左氧氟沙星、恩诺沙星等药呈中度耐受。本结果与梁利国等(2013)和胡琳琳等(2008)的研究结果相似，但与杨移斌等(2017)的研究结果有所不同。2株迟缓爱德华菌对庆大霉素、氨苄西林、青霉素、复方新诺明耐药，对氟苯尼考、卡那霉素、阿米卡星中度耐受，与刘韬等(2014)的研究结果相似，实验结果不同可能是和渔场日常使用抗生素的不同有关，重复的使用一种抗生素，是造成细菌耐药的主要原因之一。据报道，使用中草药治疗鱼类细菌病具有安全、绿色、环保、减少耐药性、降低生产成本、提高鱼体抵抗力的优点，使其在防控鱼类细菌病中有一定的优势。陈晓利(2010)报道，五倍子、黄芩和杨树花对温和气单胞菌抑菌效果较好。梁利国等(2010)、高桂生等(2016)和金洁南(2016)也对温和气单胞菌进行过中草药抗菌研究，结果表明，使用中草药治疗气单胞菌引起的水产病害是可行的。陈言峰等(2011)和刘春等(2013)使用五倍子和石榴皮对迟缓爱德华菌进行体外抑菌实验，证明二者抑菌作用明显。张文青等(2012)实验证明五倍子、五味子和乌梅对嗜水气单胞菌有明显抑菌作用。这些结果均可为温和气单胞菌、迟缓爱德华菌感染引起的水生动物细菌病的中草药治疗提供科学、安全的用药依据。

表3 人工回感实验

Tab.3 Artificial experimental infection

河鲈是我国仅分布于额尔齐斯河和乌伦古湖的一种名贵冷水性鱼类，本研究首次对人工养殖的河鲈进行了细菌病的研究，从其体内分离并鉴定出2种致病菌，且均具有较高的致病性及致死性。目前，以河鲈等为代表的额尔齐斯河土著鱼类的养殖较为活跃，其细菌病的防控不容小觑。

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Isolation, Identification, and Antibiotic Sensitivity of Bacillary Enteritis inLinnaeus

YANG Kunming, GUO Aimin, MA Jiangxia, DUAN Chengren, XIE Zhisheng, YUE Cheng①

(College of Veterinary Medicine, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052)

The current development of Xinjiang indigenous fishlarge-scale farming has been listed for the positioning and development of aquaculture in Xinjiang.Linnaeus is an indigenous fish and peculiar to the Ergis River in Xinjiang.is a cold-water fish, but very few studies have investigated cold-water fish diseases, including bacterial disease. Presently, artificial breeding of perch is being initiated. However, there have been few analyses of disease in perch. In 2016, a large number of perch in the Wujiaqu Fisheries Extension Station died suddenly. Diseased fish exhibited anal swelling, abdominal swelling, surface scale cast-off, rotten tail, and rotten gill symptoms. The dominant bacterial strain was isolated from the fish liver and intestines.After culturing for 24 h at 20℃, ZL1 formed neat edges with a slight uplift in the middle, a smooth surface, a light-yellow color, a special aromatic odor, and bacterial colonies 1.5~2 mm in size. It formed a clear β-hemolysis circle on blood agar. ZL3 and ZL5 formed a round, slightly uplifted, smooth, moist, off-white, translucent, colony of 0.5~1 mm in size, but did not form a hemolysis circle on blood agar. The isolated bacteria were cultured, the bacterial species were identified, and drug susceptibility and pathogenicity tests were performed. Pathogenicity tests and morphological observation showed that the isolates had obvious pathogenicity. Gram staining, physiological and biochemical characteristics, analysis of 16S rRNA gene sequences, and phylogenetic tree development identified ZL1 asand ZL3 and ZL5 as. Drug sensitivity test showed that ZL1 was highly sensitive to gentamycin, minocycline, and ceftazidime, and resistant to streptomycin, penicillin, and clarithromycin. ZL3 and ZL5 were highly sensitive to levofloxacin, streptomycin, and enrofloxacin, and resistant to gentamicin, ampicillin, penicillin, and sulfamethoxazole.

Linnaeus;;; Identification; Drug sensitive test

YUE Cheng, E-mail: yuechengxnd@aliyun.com

杨昆明, 郭爱民, 马江霞, 段成任, 谢志胜, 岳城. 河鲈细菌性肠炎致病菌的分离、鉴定及药敏实验. 渔业科学进展, 2018, 39(6): 42–51

Yang KM, Guo AM, Ma JX, Duan CR, Xie ZS, Yue C. Isolation, identification, and antibiotic sensitivity of bacillary enteritis inLinnaeus. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(6): 42–51

* 国家自然科学基金项目(31360644)、国家科技支撑计划项目(2012BAD25B10-03)、新疆维吾尔自治区推广项目(2016C03013)和新疆农业大学研究生科研创新项目(XJAUGRI2016006)共同资助[This work was supported by National Natural Sciences Foundation of China (31360644), National Science-Technology Support Plan Projects (2012BAD25B10-03), Xinjiang Uygur Autonomous Region Scientific and Technological Projects (2016C03013), Xinjiang Agricultural University Graduate Student Scientific Research Innovation Projects (XJAUGRI2016006)]. 杨昆明，E-mail: ykunming@aliyun.com

岳 城，教授，E-mail: yuechengxnd@aliyun.com

2017-12-05,

2017-12-22

10.19663/j.issn2095-9869.20171205002

S941.42

A

2095-9869(2018)06-0042-10

(编辑 马璀艳)