TGF—β信号通路促进小鼠乳腺癌活检相关性肺转移的实验研究

傅永强　郭方明　陈浩浩

[摘要] 目的 探讨空芯针穿刺活检（core needle biopsy，CNB）对乳腺癌远处转移的影响及其可能机制。 方法 30只BALB/c小鼠采用乳腺癌4T1细胞乳腺脂肪垫接种， 分成活检与非活检两组，活检组应用CNB建立活检相关肺转移模型，采用流式细胞术、qPCR及形态学等检测技术从肿瘤组织局部和整体水平评价其生物学行为。 结果 成功建立稳定而可靠的乳腺癌肺转移模型，活检组小鼠肺转移结节数显著高于非活检组（P<0.05）；与非活检组相比，活检组小鼠TGF-β1、SOX-4及EZH2的mRNA表达上调（P<0.05），流式细胞术检测的NK细胞增加，但差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 CNB可通过TGF-β信号通路介导的上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）等机制促进乳腺癌的肺转移。

[关键词] 乳腺癌；肺转移；活检；上皮间质转化；小鼠

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）23-0028-05

Experimental sudy on the TGF-β signaling pathway in promoting mice breast cancer biopsy-related lung metastasis

FU Yongqiang1 GUO Fangming1 CHEN Haohao1 FU Xiaoyan1 HE Guochan1 ZHANG Hui2 FANG Yuanshu2 YING Xiaoqian1 ZHANG Ning1 DING Mingxing1

1.Jinhua Polytechnic Medical School， Jinhua 321007， China； 2.Jinhua Institute of Food and Drug Test Center in Zhejiang Province， Jinhua 321007， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of core needle biopsy（CNB） on distant metastasis of breast cancer and its possible mechanism. Methods 30 BALB/c mice were inoculated with mammary fat pad of breast cancer 4T1 cells. They were divided into biopsy group and non-biopsy group. The biopsy group was given CNB to establish a biopsy-related lung metastasis model. Flow cytometry， qPCR， and morphological techniques were used to evaluate the biological behavior by the local and global levels of tumor tissues. Results After successfully establishing a stable and reliable breast cancer lung metastasis model， the number of lung metastatic nodules in the biopsy group was significantly higher than that in the non-biopsy group（P<0.05）； Compared with non-biopsy group， mRNA expression of TGF-β1， SOX-4 and EZH2 in the biopsy group was up-regulated（P<0.05）. NK cells detected by flow cytometry were increased， but the difference was not statistically significant（P>0.05）. Conclusion CNB can promote lung metastasis of breast cancer through TGF-β signaling pathway-mediated epithelial-mesenchymal transition （EMT） and other mechanisms.

[Key words] Breast cancer； Pulmonary metastasis； Biopsy； Epithelial-mesenchymal transition （EMT）； Mice

乳腺癌的發病率和致死率均高居女性恶性肿瘤首位，转移和侵袭是其致死的主要原因，故筛查和早期检测对于改善患者预后及生活质量极为关键[1，2]。其中空芯针穿刺活检（core needle biopsy，CNB）是目前主要的活检方法，但其对临床患者结局的影响和潜在风险尚有争议，CNB可增加乳腺癌患者肿瘤细胞的针道种植及穿刺部位皮肤转移的机会，并有促进肿瘤局部复发及远处转移的风险[3，4]。其机制可能涉及一系列肿瘤细胞与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的相互作用过程，而TGF-β信号通路通过其下游的多种转录因子介导的上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在乳腺癌发生及转移中有重要作用[5]。新近发现，SOX转录因子中SOX-4参与调控TGF-β1诱导的人乳腺上皮细胞EMT过程，通过EZH2基因表观遗传修饰发挥作用，可作为临床三阴性乳腺癌的潜在生物标志[6，7]。本文应用小鼠乳腺癌4T1细胞乳腺脂肪垫接种结合CNB建立活检相关肺转移模型[8]，从TGF-β1、SOX-4及EZH2等基因活化程度证实EMT的促进远处转移效应，为正确评价乳腺癌活检及手术的有效性与安全性、探讨乳腺癌肺转移的生物学机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器 小鼠乳腺癌细胞株4T1由中国科学院上海细胞库提供，L-谷氨酰胺、双抗、Dulbecco's Modified Eagle Media（DMEM）培养基、胎牛血清（均为Gibco公司产品，美国），高纯总RNA快速提取试剂盒（Generay公司，GK3016），逆转录试剂盒HiScript-II Q RT SuperMix for qPCR（Vazyme公司，R222-01），qPCR试剂ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix（Vazyme公司，Q411-02），實验引物由上海桑尼生物科技有限公司合成、纯化，Anti mouse CD49b-APC抗体（ebio公司，17-5971-81），Anti mouse CD3-FITC抗体（ebio公司， 11-0032-80），流式细胞仪（Accμri C6，BD公司），显微镜（BX43型，OLYMPUS公司），隔水式恒温培养箱（PYX-DHS500BS-Ⅱ型，上海跃进医疗器械有限公司）。

1.1.2 实验动物及饲养 30只4～6周龄雌性BALB/c小鼠由上海斯莱克有限公司提供，生产许可证号为SCXK（沪）2012-0002，合格证号：0300203；SPF级，购入时动物体重为16～20 g。饮用水为灭菌二级超纯水，饮用水质量符合中华人民共和国国家标准《生活饮用水卫生标准》[9]GB5749-2006）的规定。实验动物房使用许可证号为SYXK（浙）2015-0008，饲养环境：温度范围20℃～25℃，相对湿度范围40%～70%。维持饲料：由上海斯莱克实验动物有限公司提供，执行标准GB14924.3-2010《实验动物配合饲料营养成分》[10]。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清100 IU/mL青霉素，100 g/mL链霉素的DMEM培养基作为4T1细胞的培养液，于5% CO2，37℃细胞培养箱内常规培养。

1.2.2 小鼠乳腺原位肿瘤及肺转移模型的建立 BALB/c小鼠采用1%戊巴比妥钠（Merck，上海化学试剂公司进口分装，CAS号57-33-0）（6 μL/g）腹腔内注射麻醉麻醉成功后，在严格无菌操作下于胸部正中处切开2 cm大小的切口，钝性分离至双侧乳房脂肪垫处准备接种细胞；收集处于对数生长期的4T1细胞，1000 rpm离心5 min，调整细胞浓度至2×105个/mL制备单细胞悬液，以1 mL空针将细胞悬液吹打混匀后，取0.05 mL接种于小鼠第3对乳房脂肪垫处，双侧各含细胞数1×104个，注射部位出现明显皮丘后缝合切口。接种3周后，大部分小鼠瘤径达到6 mm左右，可进行后续实验。

1.2.3 活检处理及肿瘤切除 BALB/c小鼠30只分为两组，即：活检组和非活检组，每组各15只。活检处理：小鼠采用1%戊巴比妥钠（Merck，上海化学试剂公司进口分装，CAS号57-33-0）（6 μL/g）腹腔内注射麻醉，3～5 min麻醉成功后，瘤体侧朝上固定小鼠，使用碘伏进行瘤体部位局部消毒，进行无菌手术准备，用带有5 mL注射器18号针头CNB空芯针进行肿瘤穿刺，穿刺入针点于肿瘤中心位置，然后于掌状辐射方向6～8个来回并保证穿刺在肿瘤的平均分布；非活检处理：作为对照不接受穿刺，但同样经受完全麻醉的手术准备过程，在相同实验室持续相同时间。

上述所有活检和非活检小鼠在穿刺后7 d进行肿瘤切除手术：小鼠同样采用上述方法麻醉成功后，使用碘伏进行全身性消毒，在严格无菌操作下于胸部正中处切开2～3 cm大小的切口，手术切除乳腺肿瘤，清除所有肿瘤组织以免局部复发，术后缝合切口，再次使用碘伏进行消毒防止造成伤口感染。

1.2.4 形态及组织病理学检查 切除的肿瘤组织液氮冷冻保存，用于后续PCR及免疫组化等组织病理分析。从肿瘤细胞接种到乳腺肿瘤切除期间每天观察乳腺肿瘤生长情况，每周测量肿块的大小。按公式V=1/2×长×宽×宽，计算双侧肿瘤大小并绘制生长曲线[11]。活检后1周开始每周处死3只小鼠直至处死全部小鼠。

肿瘤生长至45 d，将小鼠安乐死后取出肺，在解剖显微镜下计数肺转移结节数量并测量转移瘤直径，进行分类计数，公式如下：肺表面转移结节总数=I×1+Ⅱ×2+Ⅲ×3+Ⅳ×4（据肺结节直径将其分为4级：I级<0.5 mm，0.5 mm≤Ⅱ级<1 mm，1 mm≥Ⅲ级≤2 mm，Ⅳ>2 mm）。取出的肿瘤组织、肺脏标本，浸于10%中性福尔马林中充分固定48 h，常规石蜡包埋切片，HE染色，400倍光镜下观察。

1.2.5 荧光定量PCR RNA提取、纯度的测定和RNA的定量：按Trizol操作说明，Trizol-离心柱法提取样本总RNA用于qPCR。以相应溶剂为对照（Blank），取2 μL RNA溶液于Merinton SMA4000检测，观察A260/A280、A260/A230比值及连续波长吸收峰，并计算RNA溶液浓度，判断RNA提取质量：A260/A280>2.0且<2.3，则可以满足后续RT-qPCR所需。

荧光定量PCR扩增实验：逆转录实验中的RT反应液：5×HiScriptR Ⅱ qRT SuperMix 4 μL，Total RNA≤1000 ng，RNase Free dH2O加至20 μL。

各基因引物序列见表1。PCR扩增反应体系：2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 10 μL，Forward primer，10 μM，0.6 μL，Reverse primer，10 μM，0.6 μlTemplate cDNA 8.8 μL，ddH2O加至20 μL。qPCR实验参数：95.0℃ for 30 s，95.0℃ for 10 s，60.0℃ for 30 s Plate Read，GOTO 2，40 reps，Melt Curve 70℃ to 95℃：Increment 0.5℃ for 5 s Plate Read。见表1。

1.2.6 流式细胞术 取小鼠脾脏，剔除脂肪组织后剪成5 mm×5 mm小块，收集脾脏细胞悬液，300×g，10 min，收集细胞沉淀，无血清培养基重悬后过200目筛网；将细胞悬液慢慢滴入等体积的分离液中，水平离心，500×g，20 min，收集第二层白色细胞悬液，弃红细胞层。5倍体积洗涤液重悬细胞，300×g，5 min，漂洗细胞2遍，100 μL staining bμffer重悬细胞，置于冰上，待孵育抗体。同时加入CD49b-APC和CD3-FITC抗体，室温避光孵育30 min。另设CD49b-APC单染组和CD3-FITC单染组和空白组（不加任何抗体）。300×g，5 min，离心收集上述组别的细胞沉淀；500 μL staining buffer重悬细胞，以FL-1A通道检测CD3-FITC信号，FL-4A通道检测CD49b-APC信号。空白组用以确定阴性区域，相应一抗单染组确定阳性表达区域，NK细胞为CD49b阳性CD3阴性细胞（散点图中UL区域）。

1.3 统计学处理

应用SPSS 19.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，对于单变量分析中，分类变量采用χ2检验及Mann-Whitney U检验，连续变量用两两t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠乳腺癌细胞株4T1活检相关性肺转移模型的建立

结果表明，乳腺癌细胞株4T1细胞接种14 d后成功建立小鼠乳腺癌原位瘤模型。活检处理7 d后，活检组小鼠肿瘤瘤体积大于非活检组小鼠肿瘤瘤体积，但差异无统计学意义（P>0.05）。手术切除肿瘤后小鼠状态较差，活检组有1例死亡，成活率为93.33%（14/15），非活检组全部存活（图1）。

2.2 活检组与非活检组远处转移情况

上述两组于活检后1周开始每周处死3只小鼠直至处死全部小鼠，开胸取肺观察，全部小鼠均发生肺转移，计算肺表面转移结节数，结果见表2；HE染色光镜观察可见肺内有肿瘤细胞转移灶，与正常肺组织相比，转移瘤细胞排列紧密、核大深染、核膜清晰、核仁明顯，分裂相多见，病理组织学诊断为浸润性癌巢，见图2。活检组与非活检组累计转移肺结节计数分别为35个和24个，差异有统计学意义（Mann-Whitney U检验，Z=-3.29，P<0.05）（表2）。各组小鼠淋巴和心脏组织均有发生癌细胞转移，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.3 qPCR检测活检组和非活检组裸鼠乳腺肿瘤及肺组织中TGF-β1、SOX-4、EZH2的mRNA表达

活检组小鼠乳腺肿瘤组织中TGF-β1、SOX-4、EZH2的mRNA表达上调，与非活检组组比较差异均有统计学意义（P<0.05），但两组小鼠肺组织中TGF-β1、SOX-4、EZH2的mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.4 流式细胞仪检测脾脏NK细胞（CD49b+CD3-）的比例

活检组手术后1周和手术后2周含量与手术当日比较，NK细胞有上升趋势（P<0.05），而非活检组手术后2周含量与手术当日比较，NK细胞有上升趋势（P<0.05）；相同时间点样本，活检组NK细胞含量低于非活检组，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表4，图3。

3 讨论

CNB的应用尽管可以在早期确诊乳腺癌，但长期以来，与执行CNB相关的临床效果和潜在风险一直备受争议。有报道CNB增加了乳腺癌患者针道播种和局部肿瘤复发的风险，但乳腺癌细胞是否在活检程序后进入淋巴管并迁移到淋巴结，从而通过淋巴管和血管通道有效建立远处转移尚未得到证实[3，4]，故其增加肿瘤局部复发及远处转移的风险尚需更多的证据[12]。

本研究首先将小鼠乳腺4T1肿瘤细胞同位移植到BALB/c小鼠中，并且在2周内肿瘤生长后试验性地复制使用CNB，以模拟临床进行活组织检查。在这个模型实验中，肿瘤自发地从乳腺脂肪垫转移到淋巴结，肺和心脏等，与人乳腺癌中观察到的情况类似[13]。在成功建立4T1细胞株BALB/c小鼠转移性乳腺癌模型后，本研究评估了CNB对以下病理机制的影响：（1）发生肺、淋巴结及心等远处转移情况；（2）肿瘤微环境中细胞和细胞因子等免疫状态的改变；（3）涉及EMT公认的TGF-β1、SOX-4、EZH2等分子的表达，最终从小鼠局部与整体的评价该模型，为进一步的研究奠定基础。

本研究结果表明，与无活检组小鼠相比，CNB在小鼠乳腺癌中能显着增加肺、淋巴结及心等远处转移的发生率。既往研究表明，类似这些转移的增加与肿瘤微环境内的早期免疫抑制性变化相关，这些变化包括炎症反应、募集骨髓来源的抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）和伴随的NK细胞的下调，并有证据支持CNB通过激活EMT的基因（包括涉及TGF-β发起的SOX-4/EZH2，EMT途径）的基因上调后促进早期转移的机制[6，7，10]。在荷瘤小鼠中已发现脾脏T细胞的显着减少及巨噬细胞的增加，但未见有任何与活检相互作用而发生改变的报道[14]。本研究发现，活检后小鼠脾内的NK细胞有下降趋势，提示可能产生了免疫抑制，推测这些变化与这种活检后细胞因子谱变化有关，造成有利于亲转移性肿瘤微环境[15]。新近研究表明，与4T1细胞相比，肿瘤干细胞可以有效激活血小板，诱导血小板分泌更多的TGF-β1，降低NKG2D的表达，抑制NK细胞的抗肿瘤活性[16]。但其进一步的确切机制尚待研究。

进而，本研究的qPCR结果发现，活检后TGF-β1的表达及与之相关SOX-4、EZH2等mRNA显著增加，而这些目前认为是主要的EMT调节因子[17]。这些发现表明通过TGF-β1/SOX-4 EMT途径的激活，可能有助于循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）的迁移和外渗，从而增加转移的机会[18]。SOX-4除了能够激活TGF-β信号通路外，还能够将癌症上皮细胞转变成肿瘤干细胞，SOX-4提高了CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞的比例，表明SOX-4能够诱导乳腺上皮细胞产生具有干细胞特性的细胞[19]。以前的研究表明，SOX-4的表达与早期淋巴结阴性患者的转移相关结果差有关，而另一项研究则将SOX-4表达与三阴性乳腺癌患者相关联，因此作为预后差的标记[6，7]。SOX4可与EZH结合，促进EZH2表达，增加H3K27me3诱导EMT发生[7]。EZH2作为果蝇Zeste基因增强子的人类同源物，具有组蛋白甲基转移酶活性，可通过抑制E-cadherin的表达直接诱导EMT发生，促进肿瘤转移[20]。结合这些研究，我们的发现证实EMT和相关分子在CNB诱导的乳腺癌转移中起关键作用，EMT允许肿瘤细胞转化为侵袭性间充质表型，从而渗入循环系统及远处器官。新近认为miRNA在乳腺癌细胞SOX-4 EMT中起重要的调节作用[21]，可能为将来研究的突破点。EMT调控因子SOX-4和EZH2在乳腺癌组织中表达上调，有望成为预测乳腺癌转移的潜在生物学标志物[22，23]。

總之，我们的实验结果证明，乳腺癌小鼠模型中CNB与肺转移的发生率显着增加有关，其机制可能与CNB具有免疫抑制和促转移性肿瘤微环境，且升高TGF-β1/SOX-4相关的EMT水平有关。

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（收稿日期：2018-02-07）