南瓜DNA提取方法比较分析

陈学进 郭卫丽 姜立娜 李新峥 周俊国

摘要：DNA提取是基因克隆、PCR扩增、分子杂交以及遗传多态性分析等实验的基础。Whatman FTA卡已广泛应用于DNA的保存和提取，具有简便和高效的特点。采用煮沸法和FTA法分别提取南瓜（Cucurbita nwschata Duch.）根、茎、叶DNA，以常规CTAB法为对照，以期寻找一种简便快捷的DNA提取方法。结果表明，CTAB法适用于南瓜各组织部位的DNA提取，DNA质量最高，PCR扩增的条带清晰，亮度高，但实验操作也最复杂;用煮沸法从叶片中提取的DNA质量相对较好，从根和茎提取的DNA不宜用于PCR反应，实验操作相对简单;FTA法提取的DNA质量较好，PCR扩增的条带清晰，亮度较高，实验操作最简单，是一种最佳的DNA简化提取方法。

关键词：南瓜;DNA;CTAB;煮沸法;FTA法

南瓜（Cucurbita moschata Duch.）是葫芦科南瓜属一年生蔬菜，在世界范围内广泛栽培和食用[1]。南瓜果实营养丰富，含有糖类、维生素、多种氨基酸和矿物质等，南瓜还富含保健活性物质，具有抗氧化功效，南瓜多糖具有降血糖的作用[2-4]。南瓜还可作为其他瓜类蔬菜的砧木，提高嫁接苗的抗逆性及产量[5-6]。

南瓜DNA的提取是南瓜基因克隆，PCR扩增、分子杂交以及遗传多态性分析等分子生物学研究的基础。植物DNA提取的方法较多，如CTAB法、SDS法、试剂盒提取等[7]，文献报道关于DNA的提取多为改进或提高DNA质量的方法[8]，鲜有DNA提取方法的简化。其中CTAB法是最常用的经典方法。作为一种阳离子去污剂，CTAB可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，该复合物在高盐浓度下可溶解，在低盐浓度下会因溶解度降低而沉淀，通过离心可将CTAB- 核酸复合物同蛋白质、多糖等物质分开，然后用高盐溶液溶解CTAB- 核酸复合物，再用乙醇沉淀DNA而除去CTAB。该法需要经过预热、研磨、保温、2次离心等步骤，时间长、过程复杂，需要配置多种试剂，但提取的DNA质量较好。煮沸法提取DNA是在加入TE缓冲液之后，植物组织经过一冷一热极端的温度差，然后经过离心获得DNA，操作过程进行了简化，但提取的DNA质量不及CTAB法[9]。FTA法是将植物材料DNA保存在Whatman FTA卡（Flinders Technology Associates，简称FTA卡）上，经过FTA洗脱液洗脱、高温处理，FTA卡上的DNA释放到TE-1缓冲溶液中，进而获得DNA的一种方法[10-11]。FTA卡已广泛应用于动物、植物、微生物及噬菌体DNA的提取，FTA卡上的DNA可以长期保存，节省DNA存储空间，可随时用于DNA提取，方便快捷[12-14]，但提取的DNA质量一般。实践证明，在满足实验要求的前提下，简化DNA提取可大幅提高实验效率。

笔者以河南科技学院南瓜创新团队培育的南瓜品种‘百蜜一号为试材[15]，采用煮沸法和FTA法分别对南瓜根、茎和叶进行DNA提取，以常规CTAB法为对照，以期寻找一种简便快捷的DNA提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料

南瓜品种为‘百蜜一号，是由河南科技学院南瓜创新团队培育的杂交品种。

1.2 方法

CTAB法：1.5 mL离心管中加入0.4 mL CTAB提取缓冲液，65℃恒温水浴锅中预热，取适量新鲜材料研磨成粉。转至提取缓冲液中，保温30min，期间轻柔搅动，加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），旋涡震荡，静置10min后10000r·min^-1离心10min。取上清液，加入2/3体积的异丙醇，混匀，室温放置15min后10000r·min^-1离心10min，去上清液，用70%（φ）乙醇冲洗2次，风干。用50μL TE缓冲液溶解DNA，取1μL用Nanodrop 2000进行DNA质量和浓度的检测。

煮沸法：取适量新鲜材料在研钵中研磨粉碎，加入0.4mL TE缓冲液，倒入离心管中;沸水中煮1～10min，之后立刻冰浴10min。最后在室温13000r·min^-1离心5min;取上清液作为DNA样品[9]。取1μL用Nanodrop 2000进行DNA质量和浓度的检测。

FTA法：Whatman FTA卡购于上海仁邦医药科技有限公司。将适量南瓜组织放在FTA卡上，垫上封口膜，用力按压使汁液被FTA卡吸收，室温晾干。用打孔器在FTA卡上有组织印记的区域打孔，将得到的圆形纸饼放入离心管，加入50μL的FTA溶液浸泡5min，吸出;加入200 I-LL的TE-1溶液浸泡1min，吸出：再加入200μL的TE-1溶液浸泡1min，吸出;加入50μL TE缓冲液，将离心管盖好，放入干式恒温器中，95℃加热巧min，取出后室温冷却。取1μL用Nanodrop 2000进行DNA质量和浓度的检测。

以上述3种方法提取的DNA样品为模板进行PCR反应及电泳检测。PCR引物来自于国际葫芦科基因组数据库（http：//cucurbitgenomics.org/）美洲南瓜（Cucurbita pepo L.） SSR分子标记数据库，正向引物序列：5-GGAAGAAGAGAGGTTGTGCG-3'，反向引物序列：5-CGTTTTCTGTGGC-CATTTCT-3，PCR反应体系总体积20μL，其中模板1μL，10×缓冲液2μL， dNTP1.6μL，正向及反向引物各0.3μL，Taq DNA聚合酶0.1μL， dd Hz014.7μL。PCR反应程序为：94℃2min，94℃20s，58℃30s，72℃1min，35个循环。

PCR扩增产物的电泳检测：每个样品加入2μL溴酚蓝上样缓冲液，用1xTAE缓冲液配置1%（ω）的琼脂糖凝胶，加入适量Goldview核酸染料，120V條件下电泳30min后采用凝胶成像系统拍照。

2 结果与分析

2.1 DNA质量及浓度检测

为简化试验操作，3种提取方法均未准确称取样品，根据表1的试验结果，3种提取方法、从不同组织得到的DNA浓度各不相同，也说明了这一点，但是表1中浓度均基本满足一般生物技术的实验操作所需浓度，说明本试验中DNA提取不需要准确称取样品，取样适量即可。

比较3种提取方法，CTAB法获得的DNA质量最高，如表1所示，OD₂₆₀/OD₂₈₀均在2.0左右，说明样品 DNA中蛋自含量较低;OD₂₆₀/OD₂₃₀均高于1.9，说明样品DNA中小分子杂质较少，从不同的南瓜组织（根、茎、叶）提取的DNA质量差异不明显，说明这些组织均可用CTAB法提取DNA。煮沸法和FTA法得到的DNA质量总体不高，尤其是以根和茎为提取组织时，但从叶片提取的DNA质量OD₂₆₀/OD₂₈₀均在1.8左右，OD₂₆₀/OD₂₃₀也在1.8左右，基本可以满足一般生物技术的实验需求。

2.2 PCR检测

为了检测提取的DNA样品能否用于PCR反应，将上述3种方法提取的根、茎、叶组织DNA分别进行PCR反应。结果表明，CTAB法提取的DNA作为PCR反应的模板扩增得到的条带清晰，亮度较高，效果最佳;煮沸法提取的DNA经过PCR扩增后，条带隐约可见，亮度低，只有叶片组织的条带亮度稍微高一些。FTA法提取的DNA作为PCR反应的模板，扩增得到的条带清晰，亮度较高，效果较好（图1）。

3 讨论与结论

为了找到简单、快捷、高效且适用南瓜基因组DNA的提取方法，笔者以煮沸法和FTA法分别从南瓜的根、茎、叶进行DNA提取，并以常规CTAB法作为参照。经过比较，CTAB法提取的DNA质量最好，但操作程序繁琐，需要的試剂多，操作时间长。煮沸法只需要离心1次，操作过程相对简单，时间短，但得到的DNA质量欠佳。FTA法不需要研磨和离心，需要的试剂较少，操作方便，还可根据需要将材料DNA随时保存，与CTAB法相比具有高效、便捷的优点，虽然提取的DNA质量不及CTAB法，但可满足一般PCR反应。提取样品量较大时，FTA法的优势更加明显。综合比较，FTA法操作最简单，是提取叶片DNA的最佳方法。

FTA法是Whatman公司的一项专利技术，主要应用于室温下DNA的采集、存贮及提取，采集的样品通常是血液、口腔细胞等[13]，有文献报道，拟南芥大规模批量提取DNA时采用FTA法更加简便快捷，且成本很低[14]，但FTA法在其他植物上的应用鲜有报道。通过与经典的CTAB法和煮沸法比较，笔者为简化南瓜DNA提取提供了一条更优途径，是FTA法在南瓜DNA提取上的首次应用，也为探索南瓜DNA快捷提取提供了有价值的参考。

本试验中，笔者以叶片为材料，3种方法提取的DNA均可用于一般的PCR反应，但其能否满足基因克隆等其他生物技术实验要求，还需要进一步验证。

参考文献

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