MicroRNA-9和microRNA-210检测联合彩色多普勒超声诊断乳腺癌的价值*

徐静，努尔兰·吐尔逊，王士光，王萍，谢芳

[1.四川省人民医院东院 超声科，成都 610101；2.新疆医科大学第三临床医院（附属肿瘤医院） 影像中心，新疆 乌鲁木齐 830011；3.川北医学院附属医院超声科，四川 南充 637000]

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。超声是最常用的影像学诊断方法之一，目前多应用美国放射学会超声乳腺影像报告和数据系统（BI-RADS）给乳腺肿块进行评分，但该系统分级所涉及的项目仍主要依赖医生的主观经验[1-2]。肿瘤标志物的检测客观性较好，其中人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）的蛋白表达与基因扩增状态已成为乳腺癌选择临床治疗方案与判断预后的重要标准[3-4]，但其单项检测的敏感性有限，漏诊率大。因此探索更具特异性和敏感性的早期诊断方法具有重要的临床应用价值。近年来，微RNA（microRNA,miRNA）在癌症的发生、转移和增殖中的作用得到了进一步地探索，SUN等[5]研究显示miR-9在肝细胞癌、乳腺癌等中表达显著升高。TOYAMA等[6]研究表明，miR-210的高表达是日本三重阴性乳腺癌患者预后不良的独立因素。杨浚沨等[7]研究显示，miRNA联合诊断乳腺癌比HER2等单一指标诊断具有更大的优势。但尚未有研究表明miRNA检测与影像学手段联合是否具有更高的诊断价值。因此，本研究利用miR-9、miR-210和彩色多普勒超声对乳腺癌进行联合诊断，旨在为临床早期诊断、筛查乳腺癌提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2015年3月至2018年3月四川省人民医院东院乳腺外科收治的患者。均经该院病理科术后病理确诊。确诊为乳腺恶性肿瘤的患者175例（乳腺癌组），其中，浸润性癌168例（浸润性导管癌165例、浸润性小叶癌3例）、导管内癌7例；平均年龄（51.01±7.18）岁；均为女性。确诊为乳腺良性病变的患者162例（良性病变组），其中，乳腺上皮增生94例（腺病86例、乳腺小叶增生4例、乳腺上皮不典型增生4例）、上皮良性肿瘤62例（单纯纤维腺瘤45例、导管内乳头状瘤17例）、脂肪瘤5例、感染性肉芽肿1例；平均年龄（50.80±6.91）岁；均为女性。纳入标准：①患者术后病理诊断明确；②所有患者术前均未接受放化疗；③精神状态良好，生命体征平稳，能配合研究者。排除标准：合并其他恶性肿瘤、严重心脑血管疾病、肝肾功能不全及内分泌失调疾病等。本研究获该院伦理委员会批准，所有患者均已签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂

德国GE LOGIQ E9彩色多普勒超声诊断仪，离心机购自美国Sigma公司，PCR仪购自美国BIO-RAD公司。miRNeasy Mini Kit试剂盒（德国QIAGEN公司），All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit试剂盒（美国GeneCopoeia公司），ELISA定量试剂盒（美国Bender公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 超声检查 使用GE LOGIQ E9彩色多普勒超声诊断仪，ML6-15探头，频率为6～15 MHz。患者取仰卧位，充分暴露双侧乳腺、腋窝及锁骨上窝，常规超声扫描，探头分别做纵向、斜向、横向及多方位扫查，观察各乳腺病灶的形状、走行、边缘、回声、周围组织、钙化、病变内血管血流的阻力指数（resistance index,RI）等征像并记录。根据上述情况，参照BI-RADS分级诊断标准进行分级评价[8-9]：0级，资料不完善，需结合其他检查进行诊断；1级，未见明显异常；2级，良性改变，建议定期随访；3级，良性病变可能，建议短期随访；4级，可疑恶性病变（恶性概率3%～94%），建议活检以确诊；5级，高度可疑恶性病变（恶性概率＞95%）；6级，病理已确诊为恶性。因此，在本研究中，认为1～3级为良性改变，4～5级为恶性病变。

1.3.2 miR-9、miR-210检测 采集患者手术前空腹静脉血液标本5 ml，加入促凝管，4℃条件下4 000 r/min离心10 min，再置于4℃条件下12 000 r/min离心15 min，分离血清。分离后的血清暂时放至-80℃冰箱冷冻保存。取100～200 µl血清，按照miRNeasy Mini Kit试剂盒说明书提取血清总RNA。然后按照All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit试剂盒说明书进行RNA逆转录，并qRT-PCR检测血清miR-9、miR-210浓度，表达水平的对比以U6B浓度作为内参对照。

1.3.3 HER2检测 采集患者手术前空腹静脉血样，3 500 r/min离心5 min，取上清。按照ELISA定量试剂盒说明书操作，1∶20稀释待检血清，配置标准曲线，室温摇育2 h。酶标仪读取光密度（OD）值，绘制标准曲线，得出每个样品浓度，血清HER2＞15 ng/ml为阳性，≤15 ng/ml为阴性。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0和Medcalc统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验，计数资料使用例数表示，采用χ2检验。比较采用Logistic回归进行乳腺癌的影响因素分析，建立受试者工作特征曲线（ROC）分析潜在指标诊断乳腺癌的准确性，利用Logistic回归建立彩色多普勒超声与miR-9、miR-210检测联合诊断模型。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较

图1 乳腺良恶性肿瘤的多普勒超声声像图

两组均可触及无痛性肿块（共310例，占91.98%），多位于外上象限（共154例，占45.69%），肿块质地多较硬，也可为囊性或有柔韧感；肿块较为固定，活动度小。乳腺癌组患者可有乳头湿疹样改变，回缩固定（乳腺癌组32例，占19.75%）；乳房皮肤橘皮样改变（乳腺癌组21例，占12.96%）等。超声结果示：乳腺癌组肿块边界不清，呈锯齿状或虫蚀样向周围组织浸润，肿块边缘有厚薄不均的强回声晕环；肿块内部为弱回声或低回声，有小钙化或液化，内部和周边可探及丰富血流信号（见图1A）。良性病变组肿块边界相对清晰，肿块内回声较为均匀，内部和周边多无丰富血流信号（见图1B）。

乳腺癌家族史、月经周期不规律、BI-RADS分级恶性、HER2阳性在乳腺癌组中所占比例大于在良性病变组中的比例，差异有统计学意义（P＜0.05）。RI值、miR-9、miR-210表达水平在乳腺癌组中均高于良性病变组，差异有统计学意义（P＜0.05）。年龄在两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 乳腺癌的危险因素

以患者是否患乳腺癌为因变量，进一步分析患者乳腺癌家族史、月经周期不规律、BI-RADS分级恶性、RI值、HER2及miR-9、miR-210表达水平对乳腺癌准确诊断的影响程度，多因素Logistic分析结果显示：乳腺癌家族史、月经周期不规律、BI-RADS分级恶性、HER2及miR-9、miR-210表达水平对乳腺癌发生有影响，差异有统计学意义（P＜0.05）；分析各因素对乳腺癌准确诊断的影响程度，BI-RADS分级的影响程度最高（O^R=5.702），其次为HER2阳性（O^R=4.371）。见表2。

表1 两组患者一般资料比较

表2 乳腺癌危险因素的多因素分析

2.3 HER2、彩色多普勒超声、miR-9和miR-210诊断乳腺癌的敏感性、特异性比较

以病理结果为金标准，HER2诊断宫颈癌的敏感性为59.43%（104/175），特异性为27.78%（45/162）。彩色多普勒超声诊断宫颈癌的敏感性为83.43%（146/175），特异性为69.14%（112/162）。血清miR-9诊断宫颈癌的AUC为0.753，敏感性为50.99%，特异性为90.63%。血清miR-210诊断宫颈癌的AUC为0.747，敏感性为51.08%，特异性94.21%（见图2）。

2.4 彩色多普勒超声联合miR-9、miR-210检测诊断乳腺癌

利用Logistic回归模型将彩色多普勒超声与血清miR-9、miR-210检测进行联合诊断，其AUC提高到0.934，敏感性为89.78%，特异性为85.12%。见图3。

图2 血清miR-9、miR-210检测诊断乳腺癌ROC曲线

图3 彩色多普勒超声联合血清miR-9、miR-210诊断乳腺癌ROC曲线

3 讨论

目前临床上常用钼靶X射线摄影作为乳腺癌筛查的主要手段，但是钼靶X射线不能检出较小的乳腺癌肿块，且对致密腺体显影较差，不利于乳腺恶性肿瘤的早期诊断。虽然彩色多普勒超声可以弥补这一不足，但其对病变性质的区别能力较低，并且应用于临床的BI-RADS标准多依赖于医生的主观判断。近年来，基因检测成为乳腺恶性肿瘤研究的新兴热点，miRNA的出现为乳腺癌的筛查与早期诊断提供了新的方向。然而miRNA进行乳腺癌的早期诊断时，其敏感性较影像学手段低，且缺乏多中心大样本量的研究支持。因此，本研究选取与乳腺癌发生密切相关的miR-9和miR-210作为标志物，联合彩色多普勒超声，旨在为乳腺癌提供准确、高效的筛查和早期诊断方式。

通过对两组一般资料的比较发现，乳腺癌组和良性病变组都有较高比例的乳腺癌家族史，且乳腺癌组有家族史人群比例更高，这与乳腺癌的遗传易感性相符[10]；月经周期不规律常与雌孕激素的失调有关，在乳腺癌组中更高比例的月经不规律发生例数也印证该点[11]。在本研究中，彩色多普勒超声可以显示大部分肿瘤内有典型的丰富血流、肿块边缘有厚薄不均的强回声晕环等特点，但部分良性病变患者亦可见局部血流丰富，因此需要有经验的医生进行辨别，而其敏感性和特异性受限。乳腺癌组中RI值较良性病变组低，表明肿瘤内有丰富血流，而RI值并不受医生经验的影响，具有更客观的特点。

新近有研究表明[12-13]，miR-9或miR-210与胃、肺、乳腺等多种肿瘤的临床分期、淋巴结转移和预后存在密切的关系。本研究显示，相较于良性病变组，乳腺癌组的血清miR-9、miR-210表达量显著升高，与既往研究一致[14]。

在多因素分析中，乳腺癌家族史、月经周期不规律、BI-RADS分级恶性、HER2表达水平、miR-9和miR-210的表达水平均为乳腺癌发生的影响因素。然而根据临床经验，问诊得到的乳腺癌家族史、月经规律与否等信息存在一定的偏差，而HER2表达水平的敏感性低[15]，故无法作为筛查乳腺癌的主要手段。因此本研究探讨miR-9、miR-210检测联合彩色多普勒超声诊断乳腺癌的诊断效能。

根据ROC曲线，分别分析彩色多普勒超声、血清miR-9、miR-210水平诊断乳腺癌的诊断效能，发现彩色多普勒超声检查敏感性较好，但依赖于医生的主观判断。血清miR-9、miR-210的AUC均在0.75左右，但其敏感性和特异性无法兼顾。两者联合检测可以有效提高诊断的准确性，AUC提高至0.934，敏感性为89.78%，特异性为85.12%，综合效能较独立诊断较好。因此，miR-9、miR-210检测联合彩色多普勒超声诊断乳腺癌具有较好的诊断效能。

综上所述，miR-9和miR-210检测联合彩色多普勒超声诊断乳腺癌准确性较高，是一种无创而高效的筛查和早期诊断方法，具有较高的临床价值，值得参考与借鉴。