UPLC法测定参附注射液5种人参皂苷及药动学研究❋

，芸霞，， ，，

(成都中医药大学药学院，四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室，省部共建国家重点 实验室培育基地，成都 611137)

中药复方制剂参附注射液最早见于宋·严用和《济生续方》，由古方参附汤经分离提取、灭菌制成[1-2]。作为一种典型的多组分传统中药，具有益气温阳、以化寒饮、振奋心阳、刚阴救逆、益气固脱、温通心脉等多重作用[3]，临床主要用于阳气暴脱的厥脱证，如预防和治疗各种心功能衰竭、休克等[4]。

参附注射液在临床有效，药理研究报道较多，但药动学报道较少，关于参附注射液在正常和心衰大鼠体内的药动学比较未见报道。因此，本研究旨在建立一种高效、灵敏的UPLC法，并用于研究大鼠注射参附注射液后5种主要人参皂苷的药动学特征，及比较其在正常和心衰大鼠体内的药动学差异，为评价参附注射液在临床应用中的功效和安全性，改善治疗方案及进一步的科学研究提供参考。

1 材料

1.1 试剂与试药

参附注射液(批号131110050，雅安三九药业有限公司)；人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc和Rd(批号分别为MUST-13041301，MUST-13041201，MUST-13102301，MUST-15011912，MUST-15020910，成都曼斯特生物科技有限公司)；甘草苷(内标，批号131127，成都克洛玛生物科技有限公司)；盐酸普罗帕酮注射液(批号140601，广州白云山明兴制药有限公司)；色谱乙腈、水(批号分别为CAS75-05-8，138683，美国Fisher公司)；其他试剂均为分析纯。

1.2 动物

SD清洁级大鼠，体质量(180～220)g，雌雄各半，由成都中医药大学动物中心提供(批号SYXK 2008-049)并检疫后用。动物实验环境于成都中医药大学国家中医药管理局中药药理科研三级实验室(TCM-2009-315)。

1.3 主要仪器

1260型超高效液相色谱仪(UPLC，美国安捷伦科技有限公司)；十万分之一电子天平(德国sartorius公司)； KQ-5200E型超声清洗波器(昆山市超声仪器有限公司)；Vortex-Genie 2涡旋振荡器(美国Scientific Industries公司)；TG16-WS型台式高速离心机(长沙湘仪离心机有限公司)；MD200-1型氮气吹扫仪(杭州奥盛仪器有限公司)；200，1000 μL移液器等(德国Eppendorf公司)；-80 ℃超低温冰箱(日本三洋电机公司)。

2 方法

2.1 色谱条件 色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18column (4.6×150 mm，5 μm)，流动相水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，0～10 min，19 %～19 % B；10～36 min，19 %～30 % B；36～40 min，30 %～40 % B；40～53 min，40 %～40 % B，流速为0.5 mL·min-1，进样量为10 μL，分析时间为53 min，后运行时间为3 min，柱温为35 ℃，检测器为二极管阵列检测器，检测波长为203 nm。

2.2 储备液和标准样品的制备 分别精密称取适量人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd和内标，用甲醇溶解分别配制成1 250、500、500、125、125 μg·mL-1的对照品储备液和98 μg·mL-1的内标，于4 ℃冰箱中冷藏。分别取适量储备液用流动相(A∶B=81∶19)稀释为不同浓度的混合标液，30 μg·mL-1的内标。取120 μL空白血浆分别精密加入80 μL混合标液，加入10 μL内标涡旋振荡30 s，再加入100 μL的10 %氨水，600 μL甲醇，涡旋振荡5 min，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液于30 ℃水浴氮气吹干，残渣加100 μL流动相溶解即得混合标准样品1、2、3、4、5、6、7、8(见表1)。选取3个浓度的混合标准样品作为混合质控样品，其中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd的浓度依次为：0.40、0.40、3.20、1.60、1.60 μg·mL-1，3.20、3.20、25.00、10.00、10.00 μg·mL-1，6.40、6.40、50.00、20.00、20.00 μg·mL-1。

表1 混合标准样品中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc和Rd浓度比较(μg/mL)

2.3 血浆样品处理

取制得的血浆200 μL加入1.5 mL的Eppendorf管中，加入10 μL内标，涡旋振荡30 s，再加入100 μL的10 %氨水，600 μL甲醇，涡旋振荡5 min，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液于30 ℃水浴氮气吹干，残渣加 100 μL的流动相溶解，涡旋振荡5 min，12 000 r·min-1离心10 min，取10 μL上清液进行检测。

2.4 药代动力学研究

按照实验室前期已建立的方法制备急性心衰大鼠模型[5-6]，随机取6只作为心衰组，另取6只正常大鼠作为正常组，分别对2组大鼠尾静脉注射1.6 mL参附注射液，然后在给药后(2、10、20、30、60、120、300、480、720、1 440 min)共10个时间点眼眶内眦静脉取血0.5 mL，于4 ℃ 3 500 r·min-1离心10 min，分离血浆于-80 ℃冷冻保存待测。通过UPLC法测定血药浓度并绘制药时曲线。

2.5 药动学参数计算

采用WinNonlin6.3软件计算药代动力学参数，如达峰浓度(Cmax)、曲线下面积(AUClast)、分布容积(Vz_F)、清除率(Cl_F)、半衰期(t1/2)、滞留时间(MRTlast)，采用SPSS 19.0统计软件进行t检验，P<0.05或P<0.01为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 方法学考察

3.1.1 专属性实验 图1显示，于样品分析的当天，取6个不同来源的大鼠空白血浆制备成3个浓度的混合质控样品，在上述色谱条件下测定人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd和内标。结果，各样品峰形良好，保留时间分别为35.528、36.064、46.503、47.320、51.006、18.764 min，色谱图证明没有内源物干扰分析和内标物质的检测。

3.1.2 线性关系考察 表2显示，分别精密吸取“2.2”项下8个标准样品10 μL在“2.1”项条件下进样，以待测物峰面积和内标峰面积的比Y为纵坐标，以待测物浓度X为横坐标进行线性回归计算，绘制标准曲线。结果表明，5种人参皂苷在一定浓度范围内成良好的相关性。

表2 人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc和Rd的线性及定量限

注：A.空白血浆；B.空白血浆分别加0.40、0.40、3.20、1.60、1.60、2.31 μg/mL人参皂苷Rg1(2)、Re(3)、Rb1(4)、Rc(5)、Rd(6)和内标(1)；C.大鼠给药参附注射液300 min后血浆样品图1 人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc和Rd血浆UPLC图

3.1.3 准确度、精密度和回收率试验 取120 μL空白血浆，分别精密加入80 μL质控混合标液，再加入10 μL内标，涡旋振荡30 s，然后加入100 μL的10 %氨水，600 μL甲醇，涡旋振荡5 min，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液于30 ℃水浴氮气吹干，残渣加流动相溶解，各浓度平行制备6份，测定5种人参皂苷与内标的峰面积，计算峰面积比为B2。另取120 μL空白血浆加入10 μL内标，涡旋振荡30 s，再加入100 μL的10 %氨水，600 μL甲醇，涡旋振荡5 min，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液于30 ℃水浴氮气吹干，残渣加流动相溶解，再加入80 μL混合标液，配置成3个浓度的混合质控样品各6份，测定人参皂苷与内标的峰面积，计算峰面积比为B1。用流动相将上述浓度的混合标液和内标溶解稀释，测定相应峰面积，计算峰面积比为B3。以 B2/B1计算回收率，以B3/B1计算基质效应。

取120 μL空白血浆分别精密加入80 μL质控混合标液，加入10 μL内标，制备3个浓度的混合质控样品，各浓度平行制备6份，所有样品在制备当天(第1天)内测定5次，在第3、5、7 d测定1次，以几种人参皂苷的随行标曲计算浓度，考察批内、批间精密度，分析测得样品浓度与实际样品浓度接近程度考察准确度。

表3、4显示，精密度、准确度考察RSD均小于15 %，回收率在80 %～105 %范围内，基质效应在90 %～110 %范围内。结果表明，本研究采用测定血浆中人参皂苷浓度的分析方法符合要求。

3.1.4 稳定性试验 表5显示，按“2.2”项方法制备混合质控样品，分别考察混合质控样品在室温储存12 h的短期稳定性，在-80 ℃储存30 d的长期稳定性，在4 ℃冰箱储存24 h处理血浆样品稳定性，在-80 ℃超低温冰箱3次冻融循环的稳定性，结果表明在上述条件下血浆样品均稳定。

3.2 药动学研究

表6、7显示，造模后心衰大鼠四肢不温、尾部发冷、毛蓬松、呼吸急促或微弱。同时，血流动力学检测发现，大鼠左心室平均压、左心室内压最大上升速率、左心室内压最大下降速率均明显下降，心率次数减少，左心室舒张末期压明显升高等[7]。参附注射液对大鼠尾静脉注射后5种人参皂苷的药动学参数。

4 讨论

本研究采用精密度高、稳定性和重复性良好，且经方法学考察符合生物样品测定要求的UPLC法测定参附注射液中5种人参皂苷成分的含量，测得人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc和Rd的含量分别为253.05、146.67、399.55、177.13、111.36 μg·mL-1。同时将该方法用于正常和心衰大鼠的药动学比较研究。但生物样品机制复杂，处理过程较繁琐，量少且成分含量低，为提高分析的准确度，保证分析质量，应选择合适的内标[8]。选择甘草苷作内标，峰形较好，保留时间适宜，与其他5种人参皂苷成分有很好的分离度。在预实验中，作者尝试液-液萃取法和蛋白沉淀法提取人参皂苷。采用乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷等萃取时提取回收率较低；采用乙腈作为沉淀试剂时效果不理想；采用甲醇作为沉淀试剂时效果较好，可均匀去除血浆蛋白。并考察1、3、5倍沉淀试剂的提取效果，结果表明3倍甲醇作为沉淀试剂时提取回收率最好，杂质干扰较小，色谱响应较高，基质效应和回收率符合生物样品的检测要求。因此，选用甲醇沉淀蛋白法处理血样操作简便，费用低，方法可靠。

表3 人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc和Rd在大鼠血浆中精密度和准确度比较

表4 人参皂苷Rg1，Re，Rb1，Rc和Rd在大鼠血浆中 的回收率和基质效应[例(%)]

表6 参附注射液对大鼠给药后人参皂苷Rg1和Re的药动学参数比较

注：与正常组比较:*P<0.05

同时，本研究建立的UPLC法已成功用于参附注射液中5种人参皂苷的药动学研究。大鼠静脉给予参附注射液后，血浆中可检测到的主要成分为人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc和Rd。与正常组比较，给药后心衰组5种人参皂苷在血浆中的Cmax均升高，AUClast均明显增加，提示5种人参皂苷在心衰大鼠体内的血药浓度升高，含量明显增加。且心衰组MRTlast均明显延长，提示5种人参皂苷在心衰大鼠体内的平均滞留时间明显延长，促进其在大鼠体内的含量增加，增强了其对心血管的有关药理作用。

表5 人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc和Rd在大鼠 血浆中的稳定性比较(RSD %)

表7 参附注射液对大鼠给药后人参皂苷Rb1、Rc和Rd的药动学参数比较

注：与正常组比较:*P<0.05，**P<0.01

综上所述，本研究建立了一种简便、灵敏的UPLC法，可同时定量检测参附注射液中5种人参皂苷成分，并成功应用于研究5种人参皂苷的药动学特征及其在正常和心衰大鼠体内的药动学差异。