水解蛇蜕的几种方法及水解产物的生物活性研究

蒋凯 严发展 丁秦超 陈鑫珉 梁文星 丁滨

摘 要：目的 比较几种蛇蜕水解方法的水解效率，并以HaCaT细胞评价水解产物的生物活性。方法 利用乙酸、NaOH、氧化还原两步法在不同温度和时间条件下水解蛇蜕；利用茚三酮法、考马斯亮蓝法检测水解产物中氨基酸及多肽的含量；用HPLC测定提水解产物分子量；利用HaCaT评价水解产物的生物活性。结果 酸水解的最适条件为80℃、2.5mol/L乙酸反应6h；碱水解的最适条件为80℃、0.625mol/L NaOH反应6h；氧化还原水解法最适试剂浓度分别为6%过硫酸氢钾、4mol/L尿素、1.25%亚硫酸氢钠；通过上述方法获得的胶原蛋白多肽分子量约为1kDa。该多肽能够促进细胞体外增殖。

关键词：蛇蜕；多肽；水解；生物活性

中图分类号：R932 文献标志码：A 文章编号：2095-2945（2018）29-0032-03

Abstract： Objective： The hydrolytic efficiency of several snake slough hydrolysis methods was contrastively studied， and bioactivity of the hydrolysate was evaluated with HaCaT. Methods： The snake slough was hydrolyzed by acetic acid， NaOH and two-step redox methods at different temperatures and time. The contents of amino acids and peptides in the hydrolysates were determined by ninhydrin and coomassie brilliant blue methods， respectively. The molecular weight of hydrolyzed products was determined by HPLC. The HaCaT was used to evaluate the biological activity of the hydrolysate. Results： The optimal conditions of acidic or alkalic hydrolysis methods were as follows： 2.5 mol/L acetic acid at 80°C for 6 h， 0. 625 mol/L NaOH at 80°C for 6 h. And the optimum reagents for redox hydrolysis was 6% potassium persulfate， 4 mol/L urea assemble 1.25% sodium bisulfite. The molecular mass of the hydrolysate was about 1 kDa. The hydrolysate could promote the cell proliferation in vitro.

Keywords： snake slough； polypeptide； hydrolysis； biological activity

蛇蜕[1]是游蛇科动物的干燥表皮膜，有龙子衣、蛇符、龙衣之称。性咸、甘、平，入肝、脾经，具有祛风、解毒、定惊、退翳的功能，富含无机盐、氨基酸、胶原蛋白等成分，可通过水解获得。胶原蛋白因其较好的物理性能和生物学特性，广泛用于医疗器械、食品添加、化妆品生产等领域[2-4]。目前国内外学者就胶原蛋白生物材料的构建已开展了大量工作[5-6]，其中主要集中在哺乳动物和水生动物来源的胶原蛋白上，而爬行动物来源的胶原蛋白开发研究尚不完善。本研究比较了几种不同水解蛇蜕的方法，并初步判断水解产物的分子量大小，验证了水解产物的生物活性。为蛇蜕水解产物的开发和应用提供了实验方法。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验中的化学及生化试剂均购自华东医药（上海）有限公司。蛇蜕经过浙江中医药大学丁志山教授鉴定分别为中华眼镜蛇（Naja atra）尖吻蝮蛇（Deinagkistrodon acutus）和大王蛇（Elaphe carinata）。

1.2 方法

1.2.1 蛇蜕氨基酸组成的对比分析。取1g蛇蜕粉，用10mL 6mol/L盐酸经N2除氧密封后置于110℃油浴中水解24h，獲得的水解产物用德国Sykam全自动氨基酸分析仪分析。

1.2.2 蛇蜕水解。碱、酸水解：取蛇蜕按质量体积比1：100分别加入不同浓度的NaOH溶液或冰醋酸溶液于4℃、40℃、80℃水浴中水解4天、24h和6h停止水解。以上水解产物置于截留分子量为1000的透析袋中浸泡在pH7的PBS溶液，至样品pH近中性。氧化还原提取：称取洗净干燥的蛇蜕浸没在一定浓度的过氧化氢钾溶液中，30℃恒温水浴加热60min后用蒸馏水洗净，并浸没于4%尿素、1% SDS、1.25%亚硫酸氢钠混合液，40℃恒温水浴加热4h，高速离心5min，取上清并调节pH至中性，-20℃冷藏。

1.2.3 氨基酸和蛋白质含量的测定。采用茚三酮分光光度计法测定氨基酸含量，考马斯亮蓝法测定蛋白含量。

1.2.4 HPLC分析水解产物。分别以乳球蛋白（35kDa）、肌红蛋白（16.9kDa）、核糖核酸酶A（13.7kDa）、尿苷

（244kDa）等11种蛋白质为标准品。用Phenomenex提供，型号 BioSep-SEC-s2000，规格300×7.80mm的柱子，以100mmol/L磷酸盐缓冲液为流动相，流速1.0mL/min分析。并以分子量对数为y轴，出峰时间为x轴，制作蛋白分子量标准曲线。以上述条件同时分析蛇蜕水解样本。

1.2.5 細胞活性实验。用不同浓度的蛇蜕水解物水溶液在37℃包被细胞培养板2h，弃去上清液后，用生理盐水润洗两次。将105个/mL HaCaT细胞转接入已包被好的培养板内，24小时之后计数各组细胞数，用试剂盒检测培养液中乳酸脱氢酶（LDH）活性。

2 结果

2.1 蛇蜕中常见氨基酸组成

对比三种蛇蜕中常见氨基酸的含量，发现仅组氨酸含量存在差异，其中尖吻蝮蛇蛇蜕中组氨酸含量最高超过1%，中华眼镜蛇含量最低仅为0.662%。

2.2 酸解、碱解效率比对实验

蛇蜕体积大、质量轻，在本研究中采用1：100质量体积比，分别用不同乙酸、NaOH在不同温度下水解不同时间。水解结束后对比分析不同条件水解产物中氨基酸（表1）和蛋白质（图1）的含量。

2.3 氧化还原水解效率对比实验

分别用1%、2%、4%、6%和8%的过硫酸氢钾溶液水解蛇蜕60min后的残渣用蒸馏水洗净，再用1M尿素和1.25M亚硫酸氢钠混合液继续水解，称重计算水解效率分别为50.2±2.82%、53.8±2.33%、71.7±2.64%、86.9±0.71%和53.8±1.23%。以水解产物中的蛋白质含量计算得水解效率分别为0.42±0.019、0.45±0.017、0.57±0.011、0.73±0.009、0.44±0.012g/g蛇蜕。

2.4 水解产物分子量

HPLC分析11种已知分子量的蛋白标准品，相同条件下分析2.5M乙酸（图2A）和氧化还原二步法（图2B）处理的蛇蜕水解物。HPLC分析显示，酸水解和氧化还原二步法水解得到的多肽保留时间为11.70min，根据校准曲线判断该多肽分子量为1kDa。

2.5 蛇蜕水解产物对细胞增殖的影响

蛇蜕水解液包被的96孔板培养的HaCaT细胞，测得各组细胞培养液中LDH活性物无明显变化。细胞计数发现，8、1.6μg/mL蛇蜕溶液能促进该细胞的分裂增殖（图3）。

3 结束语

本实验对比酸、碱、氧化还原二步法水解蛇蜕；氧化还原法的提取效率最高，酸解蛇蜕的效率高于碱水解，水解后产物为分子量月1kDa的小肽。本实验比较不同浓度和温度下的酸解效果，证实温度、浓度均对酸解效果有很大的影响。这一结果与林琳[7]、许庆陵[8]等人的研究结果相似，而碱水解似乎更多的受温度影响。此外，本研究中还优化了氧化还原法水解蛇蜕中过硫酸钾的浓度。

目前，胶原蛋白在很多领域都有重要的作用，如可以通过注射增强动物体内体外成骨的作用[9]，促进鼠坐骨神经的再生[10]，嵌入软骨细胞的胶原蛋白凝胶可以修复软骨的缺陷[11]，在体外胶原蛋白能够促进上皮、内皮和角膜细胞的增殖[12]。本研究中获得的蛇蜕多肽也有促进细胞增殖的生物活性。相信伴随着科学技术的发展，胶原蛋白的生物学功能将进一步被开发利用，胶原蛋白的提取工艺也将会不断的优化和利用。

参考文献：

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