酵母多糖对哺乳犊牛胃肠道发育及消化酶活性的影响

2018-12-13董金金高艳霞李秋凤曹玉凤许利民李建国

动物营养学报 2018年12期

董金金高艳霞李妍李秋凤曹玉凤刘博许利民李建国*

(1.河北农业大学动物科技学院，保定071001；2.河北农业大学动物医学院，保定071001；3.河北省衡水市农牧局，衡水053000；4.河北省隆化县农牧局，隆化068150)

胃肠道是动物对营养物质消化吸收的重要场所，犊牛出生后胃肠道消化机能发育不健全，直接影响犊牛对营养物质的消化吸收和犊牛的生长发育。酵母多糖(yeast polysaccharide，YPS)是从酵母细胞壁中提取出来的一种水溶性多糖，包括β-葡聚糖和甘露寡糖(MOS)[1]，可促进动物胃肠道早期发育，提高消化能力，改善动物对营养物质的消化吸收。因此，研究酵母多糖对哺乳犊牛胃肠道发育的作用和机制，对促进犊牛生长发育具有重要意义。据报道，酵母多糖作为一种绿色添加剂可以提高动物的生长性能[2-5]。本实验室同期研究中发现，添加1、2、3 g/(头·d)酵母多糖的犊牛平均日增重(ADG)和干物质采食量(DMI)均高于对照组，其中添加2 g/(头·d)酵母多糖的犊牛ADG和DMI最高，这可能是由于酵母多糖中甘露寡糖与β-葡聚糖共同作用，增加犊牛采食频率，提高动物肠道消化吸收能力，进而提高了采食量和日增重[6]。犊牛饲粮中添加75 mg/kg酵母β-葡聚糖可显著提高干物质(DM)、粗蛋白质(CP)、粗脂肪(EE)和磷(P)的消化率[7]。在肉牛饲粮中添加酵母细胞壁可提高酸性洗涤纤维(ADF)和总磷(TP)的表观消化率[4]。本实验室同期研究中也发现添加1、2、3 g/(头·d)酵母多糖显著提高了犊牛对DM、CP、EE、中性洗涤纤维(NDF)和ADF的表观消化率，说明哺乳犊牛饲粮中添加酵母多糖可以促进机体对营养物质的消化代谢[6]。关于酵母多糖可促进鸡[8]、猪[9]、鱼[10]肠道发育，增加肠道消化酶分泌[11]的研究报道较多，但有关酵母多糖对哺乳犊牛胃肠道发育及酶活性的研究甚少。因此，本试验旨在探究饲粮中添加不同剂量的酵母多糖对哺乳犊牛胃肠道发育及消化酶活性的影响，为酵母多糖在哺乳犊牛饲养中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

酵母多糖(福邦牌)由湖北安琪酵母股份有限公司生产，纯度>50%，主要成分及含量如下：20.0%≤β-葡聚糖≤30.0%，20.0%≤α-甘露聚糖肽≤30.0%，肽类及蛋白质≥30.0%，几丁质≥2.0%。

试验选择初生重[(45.00±5.29) kg]相近、健康的中国荷斯坦犊牛56头，随机分为4组，每组14头，各组间犊牛平均初生重差异不显著(P>0.05)。酵母多糖在各组的添加量分别为0(Ⅰ组)、1(Ⅱ组)、2(Ⅲ组)、3 g/(头·d)(Ⅳ组)。试验期60 d。

1.2 饲养管理

试验犊牛出生后1 h内灌服4 L初乳，之后安置于犊牛岛，均单笼饲养，自由饮水。试验期间每日每头饲喂牛奶4 kg,1～6日龄，酵母多糖添加在牛奶中，7～60日龄添加在犊牛开食料中。7日龄开始补充犊牛开食料，45日龄开始自由采食苜蓿干草。开食料组成及营养水平、鲜奶和苜蓿的营养水平参见文献[6]。

1.3 样品采集与处理

1.3.1 瘤胃及小肠食糜样品采集

各组选取4头接近平均体重、健康状况良好的犊牛，在60日龄颈静脉放血处死，立即剖开腹腔，取出瘤胃和小肠，迅速浸泡于生理盐水中。结扎十二指肠与皱胃连接处，剪断。

首先采集瘤胃食糜样品于10 mL离心管中，迅速置于液氮中，以备测定瘤胃中食糜的酶活性。除去肠系膜与小肠外部脂肪，将小肠自然平放在瓷盘中，瓷盘下用冰块降温，分别取十二指肠、空肠中部食糜10 g放入EP管中，迅速放入液氮中速冻，以备测定小肠食糜的酶活性。

1.3.2 胃肠道组织样品的采集

取瘤胃前背盲囊及十二指肠10 cm，空肠中段10 cm，用生理盐水冲洗残余内容物后结扎，迅速将样品浸泡在Bouin氏固定液中，用于制作组织切片。

1.4 样品的测定

1.4.1 食糜中酶活性的测定

瘤胃及肠道食糜中淀粉酶、脂肪酶、羧甲基纤维素酶以及瘤胃食糜的胃蛋白酶和肠道食糜的胰蛋白酶采用酶联免疫吸附法(ELISA)，按照试剂盒(中生北控生物有限公司，生产批号：201710)说明操作，利用酶标仪(北京普朗新技术有限公司，仪器型号：DNM-9602)进行测定。

1.4.2 组织切片的制作与测定

瘤胃及肠道组织切片的制作采用石蜡切片法[12]。

观察及测定：在显微镜(ToupCam)10×4倍光镜下观察并照相，用Image J软件测量瘤胃乳头长度、宽度以及黏膜厚度，小肠绒毛高度、隐窝深度和黏膜厚度。每个样本观察3个非连续切片，每张切片选取3个视野，每个视野分别测定2～6组数据。

1.5 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 19.0统计软件的单因素方差分析进行统计，并作Duncan氏法多重比较。试验结果用平均值±标准差表示，以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 酵母多糖对哺乳犊牛胃肠道食糜酶活性的影响

2.1.1 酵母多糖对哺乳犊牛瘤胃食糜酶活性的影响

由表1可见，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组瘤胃食糜淀粉酶活性比Ⅰ组分别提高了4.36%(P>0.05)、10.48%(P<0.05)、1.88%(P>0.05)。Ⅲ、Ⅳ组瘤胃食糜胃蛋白酶活性显著高于Ⅰ组(P<0.05)，分别比Ⅰ组提高了20.04%、38.00%。Ⅲ、Ⅳ组瘤胃食糜脂肪酶活性分别比Ⅰ组提高了20.12%、34.75%(P<0.05)。Ⅲ、Ⅳ组瘤胃食糜羧甲基纤维素酶活性显著高于Ⅰ组(P<0.05)，分别比Ⅰ组提高了9.61%、8.45%。

表1 酵母多糖对哺乳犊牛瘤胃食糜酶活性的影响

同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

2.1.2 酵母多糖对哺乳犊牛十二指肠食糜酶活性的影响

由表2可知，Ⅲ、Ⅳ组十二指肠食糜淀粉酶活性比Ⅰ组分别提高了37.98%、23.95%(P<0.05)。Ⅱ、Ⅲ组十二指肠食糜胰蛋白酶活性比Ⅰ组分别提高了26.17%、42.77%(P<0.01)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组十二指肠食糜脂肪酶活性显著高于Ⅰ组(P<0.05)，分别比Ⅰ组提高了19.92%、42.52%、69.33%。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组十二指肠食糜羧甲基纤维素酶活性分别比Ⅰ组提高了9.47%(P<0.05)、26.43%(P<0.01)、7.71%(P<0.05)。

表2 酵母多糖对哺乳犊牛十二指肠食糜酶活性的影响

2.1.3 酵母多糖对哺乳犊牛空肠中段食糜酶活性的影响

由表3可见，Ⅲ组空肠中段食糜淀粉酶活性比Ⅰ组提高了18.70%(P<0.05)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组空肠中段食糜胰蛋白酶活性比Ⅰ组分别提高了2.17%(P>0.05)、7.14%(P<0.01)、1.79%(P>0.05)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组空肠中段食糜脂肪酶活性比Ⅰ组提高了30.34%、65.55%、47.57%(P<0.05)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组空肠中段食糜羧甲基纤维素酶活性高于Ⅰ组，Ⅲ组比Ⅰ组提高了16.88%(P<0.05)。

表3 酵母多糖对哺乳犊牛空肠中段食糜酶活性的影响

2.2 酵母多糖对哺乳犊牛胃肠道形态结构的影响

由表4和图1可见，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组瘤胃乳头长度比Ⅰ组分别提高了11.58%、27.55%、15.86%(P<0.01)，瘤胃乳头宽度比Ⅰ组分别提高了17.72%、37.23%、25.60%(P<0.05)，瘤胃黏膜厚度比Ⅰ组分别提高了8.08%(P<0.05)、30.93%(P<0.01)、26.38%(P<0.01)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组十二指肠绒毛高度比Ⅰ组分别提高了9.74%、23.91%、14.61%(P<0.01)，隐窝深度比Ⅰ组分别降低了7.06%(P>0.05)、19.42%(P<0.05)、26.56%(P<0.05)，绒毛高度/隐窝深度(V/C)显著高于Ⅰ组(P<0.05)，Ⅳ组最高，Ⅲ、Ⅳ组差异不显著(P<0.05)。Ⅲ组空肠中段绒毛高度比Ⅰ组提高了24.56%(P<0.05)，隐窝深度比Ⅰ组降低了19.49%(P<0.05)，V/C也显著高于Ⅰ组(P<0.05)。

表4 酵母多糖对哺乳犊牛瘤胃和小肠形态发育的影响

3 讨论

3.1 酵母多糖对哺乳犊牛胃肠道食糜酶活性的影响

动物消化酶活性的变化直接反映了动物采食性能的变化，消化酶活性的高低直接影响了动物对营养物质吸收和利用的程度。孙洪新[7]试验报道，羔羊空肠中淀粉酶活性最大。王宝山[13]研究也表明，小尾寒羊各段小肠中淀粉酶活性不同，淀粉酶活性在空肠段最高，显著高于十二指肠淀粉酶活性。Wu等[14]给鱼饲喂魔芋甘露寡糖和甘露寡糖，提高了小肠中蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性。邢广林[15]研究发现，肉鸡饲粮中添加甘露寡糖提高了十二指肠消化酶活性，当添加0.1%的甘露寡糖时，十二指肠淀粉酶活性显著高于不添加组。杨敏等[16]的研究结果表明，饲料中添加0.20%～0.50%的甘露寡糖能提高鳗鲡肠道胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，说明饲料中适宜浓度的甘露寡糖可以促进欧洲鳗鲡肠道消化酶的分泌，从而促进鳗鲡生长。谭崇桂等[17]在凡纳滨对虾饲料中添加0.2% β-葡聚糖及0.4%甘露寡糖可显著提高胃蛋白酶和肝胰腺脂肪酶活性。覃志彪[18]在研究β-葡聚糖对奥尼罗非鱼消化酶活性的影响中发现，β-葡聚糖对胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及纤维素酶活性有较大的影响，在保证奥尼罗非鱼正常生长发育的同时，能够有效地增强消化酶活性，增强营养物质的消化吸收。而高进[19]在大黄鱼稚鱼饲料中添加酵母细胞壁多糖的研究中发现，酵母细胞壁多糖对肠道胰蛋白酶和淀粉酶活性无显著影响。羧甲基纤维素酶能膨胀纤维素和羧甲基纤维素，并以随机方式内切纤维素聚合体并产生纤维素糊精、纤维素二糖及葡萄糖，羧甲基纤维素酶在纤维素消化过程中起着非常重要的作用[20]。在本试验中，饲粮中添加2 g/(头·d)的酵母多糖可以提高瘤胃酶活性和肠道酶活性，酵母多糖促进了纤维分解菌的增殖与纤维素酶的产生，提高消化酶对淀粉、脂肪和蛋白质的酶解作用，促进胃肠道的形态发育，从而改善瘤胃整体发酵功能。

A：瘤胃前背盲囊；B：十二指肠中段；C：空肠中段。

A: rumen prodorsum blind sac; B: middle section of duodenum; C: middle section of jejunum.

图1酵母多糖对哺乳犊牛瘤胃和小肠形态发育的影响

Fig.1 Effects of yeast polysaccharide on rumen and intestinal morphological development of sucking calves (40×)

3.2 酵母多糖对哺乳犊牛胃肠道形态结构的影响

瘤胃功能的建立是瘤胃内容物经发酵产生的挥发性脂肪酸刺激的结果。Lesmeister等[21]研究发现，乳头高度、乳头宽度和黏膜厚度是评价瘤胃发育的重要指标。周怿等[22]在酵母β-葡聚糖对犊牛胃肠道的影响研究中得出，瘤胃乳头长度、乳头宽度和黏膜厚度随饲粮中酵母β-葡聚糖含量的增加而增加。本试验也得到相似结果，犊牛饲粮中添加2 g/(头·d)的酵母多糖可显著提高瘤胃乳头长度、乳头宽度和黏膜厚度，其原因可能是酵母多糖增加了瘤胃中挥发性脂肪酸的产量，促进了瘤胃功能的早期建立，从而加快了瘤胃的发育。

犊牛的小肠在反刍前阶段对营养物质消化吸收方面有重要的作用。小肠的绒毛高度、隐窝深度、黏膜厚度及V/C是衡量其消化吸收功能的重要指标[23]。绒毛高度和细胞数量呈显著相关关系，且绒毛高度越高，成熟的上皮细胞越多[24]；隐窝深度反映了细胞的成熟率，隐窝深度变深，表明小肠吸收养分功能降低，反之，隐窝变浅，小肠消化吸收功能增强[25]；V/C则是综合反映小肠功能状态的指标，其比值升高表示小肠黏膜的改善和其消化吸收功能的增强[26]。李玉欣等[27]在仔猪饲粮中添加毕赤酵母甘露寡糖，发现空肠绒毛高度显著增加，隐窝深度显著降低，V/C显著升高。黄俊文等[28]试验研究表明，甘露寡糖对仔猪小肠绒毛高度及V/C的增加具有显著作用。De Los Santos等[29]在火鸡饲粮中添加酵母提取的甘露寡糖，十二指肠、空肠的绒毛高度和隐窝深度始终高于不添加组，结果表明补充甘露寡糖可以加速胃肠发育成熟。温若竹[30]的研究发现，在肉鸡饲粮中添加甘露寡糖显著提高了十二指肠的V/C，且空肠V/C也基本呈升高趋势。Ferket等[31]研究表明，添加甘露寡糖并不能提高肉仔鸡小肠绒毛高度，但却显著降低了隐窝深度，且与对照组相比，V/C也显著增加。Muthusamy等[32]添加酵母细胞壁显著提高了肉鸡空肠绒毛高度。此外，给半滑舌鳎稚鱼饲料添加甘露寡糖，其微绒毛高度和皱襞高度显著高于不添加组[33]。在本试验中，添加2 g/(头·d)的酵母多糖的犊牛十二指肠、空肠的绒毛高度与V/C高于其他组，表明由于绒毛表面积增加从而促进了上皮细胞的成熟，提高了犊牛对营养物质吸收，增加了绒毛尖端消化酶的分泌活动，从而提高消化率[34]，而隐窝深度降低则可以说明酵母多糖提高了小肠的消化吸收能力。