配方奶粉中添加益生元对SD大鼠生长性能、血液生化指标和养分表观消化率的影响

2018-12-13周水岳杭远欣张岩春戴智勇潘丽娜王建武方热军

动物营养学报 2018年12期

周水岳杭远欣张岩春戴智勇潘丽娜王建武* 方热军*

(1.湖南农业大学动物科学技术学院，长沙410128；2.中南大学湘雅公共卫生学院，长沙410128；3.澳优乳业(中国)有限公司，长沙410005)

母乳作为哺乳动物出生后最重要的食物来源，含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物和生物活性物质，为婴儿的健康成长和发育提供了充足的能量和营养[1]。益生元作为母乳中第三大活性营养成分，事实上在奶粉中是缺乏的[2]。研究发现，母乳喂养的婴儿肠道微生物区系异于普通配方奶粉喂养的婴儿。母乳中含有丰富的益生元和少量益生菌，如果在普通配方奶粉中添加益生元可以提高其营养价值[3]。益生元是在动物消化道内不能被动物自身分泌的消化酶降解，但可以选择性地刺激肠道有益菌生长的一类物质，包括低聚糖、多糖、多元醇、植物提取物、蛋白质水解物等[4-5]，其中聚葡萄糖作为一种多糖就具有益生元的作用[2]。目前，广泛应用于人类食品的益生元包括乳果糖、低聚半乳糖、果寡糖、菊粉及其水解物、低聚麦芽糖和抗性淀粉等[6]。有研究表明，临床试验中菊糖型果寡糖和低聚半乳糖对人体消化和免疫健康均有良好的效果[7]；低聚半乳糖和聚葡萄糖协作可以提高猪和SD大鼠养分吸收和可能通过非体液调控机制提高记忆力[8-9]；聚葡萄糖还有影响养分吸收、免疫调节和肠道功能等作用[10]。

2011年，欧洲婴儿肠胃营养学会通过科学数据证实，在配方奶粉中添加益生元对健康婴儿一般不会引起安全和生长方面的副作用[11-12]，但是，目前研究者们对配方奶粉中添加益生元的安全性和功效还没达成共识[13]。因此，对添加益生元配方奶粉的安全性和功效的研究也成为了从事营养研究的学者的一项责任重大的工作。本试验旨在研究配方奶粉中分别添加低聚糖类益生元和多糖类益生元对SD大鼠生长性能、血液生化指标和养分表观消化率的影响，为配方奶粉进一步模拟母乳和更好地适应中国婴儿健康生长和发育的营养需要提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

配方奶粉：普通配方奶粉、添加低聚糖类益生元配方奶粉、添加多糖类益生元配方奶粉，均由澳优乳业(中国)有限公司提供。其中，添加低聚糖类益生元配方奶粉中低聚糖含量为2.13%(低聚果糖含量为1.85%，低聚半乳糖含量为0.28%)，添加多糖类益生元配方奶粉中聚葡萄糖含量为2.20%。

奶液：奶液1是由普通配方奶粉与水按1∶3的比例调制而成；奶液2是由添加低聚糖类益生元配方奶粉与水按1∶3的比例调制而成；奶液3是由添加多糖类益生元配方奶粉与水按1∶3的比例调制而成，现喂现配。

饲粮：饲粮1是由玉米、麦麸和普通配方奶粉按7∶2∶1的比例配制而成；饲粮2是由玉米、麦麸和添加低聚糖类益生元配方奶粉按7∶2∶1的比例配制而成；饲粮3是由玉米、麦麸和添加多糖类益生元配方奶粉按7∶2∶1的比例配制而成。上述饲粮均由湖南某实验动物有限公司生产。

1.2 试验动物及分组

试验动物为48只无特定病原体(SPF)级SD大鼠，15日龄(断奶前1周)，平均体重(29.39±1.89) g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，生产许可证号SCXK(湘)2014—0011。试验用SD大鼠饲养于中南大学SPF级动物实验室，温度为20～26 ℃，相对湿度为40%～70%，12 h光照、12 h黑暗。

适应性喂养3 d后，SD大鼠按体重随机分为3组，分别为对照组(A组)、低聚糖类试验组(B组)和多糖类试验组(C组)，每组16只SD大鼠，单笼饲养，饲养期为28 d，试验期间SD大鼠的饲喂情况及方法见表1。

表1 SD大鼠饲喂情况及方法

第2阶段中奶液和饲粮按7∶3的比例进行饲喂。

The milk and the feed were mixed in the ratio of 7∶3 in phase 2.

1.3 样品采集

从试验期第8天起，每天上、下午共2次，收集每笼SD大鼠的新鲜粪便(约5 g)，清理粪便中毛等杂物，混合均匀，加入 0.5 mL 10%硫酸拌匀，置于-20 ℃冰箱保存。连续收集粪样14 d，将粪样置于65 ℃烘箱中烘干，粉碎，过40目筛，用于测定养分表观消化率。

饲养试验结束后24 h空腹过夜，在试验第29天早晨称重，摘眼球采血后颈椎脱臼处死，打开腹腔，分离胃、肝脏、脾脏、肾脏、胰腺和小肠，观察是否有病变，同时称量胃(生理盐水清洗内容物)、肝脏、脾脏和肾脏的重量。其中，经乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集的新鲜血样于室温静止30 min后3 000 r/min离心15 min，得血浆，-20 ℃保存，用于测定血浆中游离氨基酸含量；经草酸钾/氟化钠管采集的血样-20 ℃保存，用于测定血液葡萄糖含量；用普通血清管采集的血样静止30 min，3 000 r/min离心15 min，得血清，-20 ℃保存，用于测定血清指标。

1.4 指标检测及方法

1.4.1 生长性能

记录SD大鼠每日采食量、初重和末重(第29天早晨)，计算平均日采食量、平均日增重及料重比。

平均日增重(g/d)=(末重-初重)/28；
平均日采食量(g/d)=总采食量/28；
料重比=总耗料量/总增重。

1.4.2 脏器指数

详细记录SD大鼠体重及脏器重量(第29天早晨)，计算脏器指数，计算公式如下：

脏器指数=脏器重量(g)/体重(g)。

1.4.3 血液生化指标

采用RP-HPLC-FMOC-CL柱前衍生化液相色谱测定血浆中游离氨基酸的含量，具体操作步骤如下。

色谱条件：色谱柱为Silversil C18柱，柱内径5 μm，柱长4.6 mm×150 mm(Dikma)；流动相A，乙腈∶水=10∶90(体积比，含0.05%甲酸)；流动相B，乙腈∶水=90∶10(体积比)；流速为1.0 mL/min。梯度程序：0～8 min，流动相B 24%～35%；8～15 min，流动相B 35%～40%；15～22 min，流动相B 40%～48%；22～25 min，流动相B 48%～64%；25～28 min，流动相B 64%～82%；28～30 min，流动相B 82%～82%；30～35 min，流动相B 82%～24%；38 min，停止。检测波长：激发波长(λex)260 nm，发射波长(λem)305 nm；进样量：20 μL；柱温：37 ℃。

衍生反应：准确吸取10 μL(10 μmol/L)标准溶液或样品，加入100 μL硼酸缓冲液(pH=9.0)、20 μL 9-芴基氯甲酸甲酯(5 mmol/L，丙酮)，60 ℃水浴反应1 h，加20 μL 1 mol/L盐酸，离心，进样20 μL。

样品处理及测定：准确量取样品100 μL，加100 μL甲醇，混匀，室温放置10 min，15 000 r/min离心10 min，取上清液10 μL和标准样品一样衍生，以峰面积定量。

血清胰岛素(Ins)和类胰岛素生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)含量采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法，在MB-530多功能酶标分析仪(深圳市汇松科技发展有限公司)上测定，具体操作步骤如下：按操作说明配制标准品、洗液工作液、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液，将各种试剂移至室温(18～25 ℃)平衡至少30 min，备用；分别设定标准孔和待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100 μL，轻轻晃动混匀，覆上板贴，置37 ℃温育2 h；弃去液体，甩干，不用洗涤；每孔加生物素标记抗体工作液100 μL，覆上新的板贴，置37 ℃温育1 h；弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡2 min，每孔200 μL，甩干；每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100 μL，覆上新的板贴，置37 ℃温育1 h；弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2 min，每孔200 μL，甩干；依序每孔加底物溶液90 μL，37 ℃避光显色15～30 min；依序每孔加终止液50 μL，终止反应；在反应终止后5 min内用MB-530多功能酶标分析仪在450 nm波长下依序测量各孔的光密度(OD)值。

血清中总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、总胆红素(T-BIL)、直接胆红素(D-BIL)、尿素氮(UN)、总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量与谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)活性及血液葡萄糖含量采用CS-T300全自动生化分析仪(长春迪瑞实业有限公司)测定，检测试剂盒由长春迪瑞医疗科技股份有限公司提供；血清碱性磷酸酶(AKP)活性采用微量酶标法测定，检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，测定方法参照试剂盒说明书。

1.4.4 养分表观消化率

饲粮和粪便中的干物质、粗蛋白质、粗脂肪含量参照《饲料分析与检测》[14]中常规分析与检测方法测定，使用酸不溶灰分(AIA)作为指示剂，AIA含量参照GB/T 23743—2009的方法测定，计算养分表观消化率[15-16]，计算公式如下：

某养分表观消化率(%)=100-(M2n/M1n)×

(M1m/M2m)×100。

式中：M1m为饲粮中AIA含量；M2m为粪便中AIA含量；M1n为饲粮中该养分含量；M2n为粪便中该养分含量。

1.5 数据统计与分析

釆用SPSS 18.0统计软件对试验数据进行单因素方差分析及Duncan氏法进行多重比较，结果以平均值±标准差(mean±SD)的形式表示，P≤0.05认为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 配方奶粉中添加益生元对SD大鼠生长性能的影响

由表2可知，配方奶粉中无论是添加低聚糖益生元还是多糖益生元对SD大鼠的平均日采食量、平均日增重和料重比均无显著影响(P>0.05)，但与对照组相比，B组平均日增重提高了3.55%，料重比降低了9.80%，C组平均日增重提高了8.33%，料重比降低了13.06%。

表2 配方奶粉中添加益生元对SD大鼠生长性能的影响

同行各组数据无字母或上标字母相同表示无显著差异(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P≤0.05)。下表同。

In the same row, values with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05),with different small letter superscripts mean significant difference (P≤0.05).The same as below.

2.2 配方奶粉中添加益生元对SD大鼠脏器指数的影响

由表3可知，3组SD大鼠的胃、肝脏、脾脏和肾脏指数均无显著差异(P>0.05)。

2.3 配方奶粉中添加益生元对SD大鼠血液生化指标的影响

由表4可知，与对照组相比，B组SD大鼠血清HDL-C含量显著提高(P≤0.05)；C组SD大鼠血清Ins、IGF-Ⅰ和HDL-C含量显著提高(P≤0.05)，血清UN含量显著降低(P≤0.05)。

由表5可知，与对照组相比，B组SD大鼠血浆非必需氨基酸中精氨酸(Arg)、丝氨酸(Ser)和丙氨酸(Ala)含量均显著提高(P≤0.05)，C组SD大鼠血浆非必需氨基酸中Arg、Ser、甘氨酸(Gly)、Ala和酪氨酸(Tyr)含量均显著提高(P≤0.05)；B组和C组血浆中赖氨酸(Lys)、色氨酸(Trp)、苏氨酸(Thr)、蛋氨酸(Met)、缬氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、亮氨酸(Leu)等必需氨基酸含量均有不同程度的提高，但差异均不显著(P>0.05)。

表3 配方奶粉中添加益生元对SD大鼠脏器指数的影响

2.4 配方奶粉中添加益生元对SD大鼠养分表观消化率的影响

由表6可知，与对照组相比，B组粗蛋白质和粗脂肪表观消化率分别提高了2.42%和5.57%，无差异显著(P>0.05)；C组粗蛋白质和粗脂肪表观消化率分别提高了7.39%和8.20%，差异显著(P≤0.05)。

3 讨论

3.1 配方奶粉中添加益生元对SD大鼠生长性能和脏器指数的影响

配方奶粉中添加益生元对幼龄动物生长性能影响的试验结果不尽相同。Costalos等[17]研究表明富含果寡糖和低聚半乳糖的配方奶粉对婴儿6～12周的生长速度无显著影响；Ashley等[18]用419个婴儿进行了为期120 d的试验，结果发现在配方奶粉中添加益生元对婴儿14～120日龄的生长速度没有显著影响；黄小流等[19]研究表明，饲粮中添加低聚果糖对断奶SD大鼠的料重比没有显著影响；杭苏琴等[20]研究发现，饲粮中添加甘露寡糖对仔猪断奶第1周的生长性能无显著影响，而对其断奶第2周以后的生长性能有显著影响。相反，有研究发现，配方奶粉中添加益生元可以增加婴儿体重，但不会影响其身高和大脑发育[21-22]。不同研究结果存在差异的原因可能与益生元种类与用量、饲粮组成及动物种类、生理状态和试验饲养环境等因素有关。本试验中，在配方奶粉中添加益生元可以从一定程度上提高SD大鼠的平均日增重和平均日采食量，降低料重比，但这种影响不显著，可能与试验重复之间数据变异较大、试验周期中换料频率及SD大鼠生理状况的改变等有关，这与一些研究结果相一致。

表4 配方奶粉中添加益生元对SD大鼠血清生化指标和血液葡萄糖含量的影响

表5 配方奶粉中添加益生元对SD大鼠血浆中游离氨基酸含量的影响

续表5项目 Items组别 GroupsABC天冬酰胺 Asn187.50±89.17133.19±84.53183.85±130.82精氨酸 Arg73.50±12.44a238.15±71.31b213.80±49.92b牛磺酸 Tau1 007.29±502.081 596.84±846.751 919.31±671.88谷氨酰胺 Gln392.24±108.34397.81±80.28436.47±176.92鸟氨酸 Orn1 567.19±281.691 788.38±416.461 819.24±677.58丝氨酸 Ser159.00±32.89a233.51±44.26b289.29±73.42b天冬氨酸 Asp18.43±15.9523.34±9.3830.15±23.82谷氨酸 Glu128.17±40.32146.32±19.11185.26±26.65甘氨酸 Gly214.05±29.89a240.73±35.19a319.22±47.55b丙氨酸 Ala434.21±65.71a817.06±36.73b892.99±122.26b酪氨酸 Tyr171.41±42.99a249.14±26.25a283.59±53.94b脯氨酸 Pro448.39±67.53533.79±112.30538.37±161.44半胱氨酸 Cys392.42±107.05368.28±142.99313.11±69.36

表6 配方奶粉中添加益生元对SD大鼠养分表观消化率的影响

健康的动物其脏器指数均在正常范围之内，内脏过大或过小均是其可能发生病变的征兆[23]。本试验中3组SD大鼠胃、肝脏、脾脏和肾脏指数均无显著差异，且均在正常生理状态的标准范围[24-25]之内，说明各配方奶粉没有改变SD大鼠的脏器结构和功能。

3.2 配方奶粉中添加益生元对SD大鼠血液生化指标的影响

益生元有降低血脂、调节脂肪代谢等作用，但具体机制目前尚不清楚[6]。血清中Ins和IGF-Ⅰ含量反映了动物机体三大营养物质代谢情况，但二者的代谢机制和途径不同，且作用也不尽相同，Ins可能主要在蛋白质分解代谢中起抑制作用，而IGF-Ⅰ可能主要在蛋白质合成代谢中起促进作用[26]。研究表明，高蛋白质水平的配方奶粉可以通过提高血浆和组织中促进Ins生成的相关氨基酸[如Leu、异亮氨酸(Ile)、Arg、Ala和Phe等[27]]的含量，进而刺激Ins和IGF-Ⅰ的分泌，促进动物机体脂肪沉积和体重增长，但也可能引起肥胖症[28]。Yang等[29]认为其他氨基酸调控Ins分泌主要通过以下途径：1)急性反应，如提高谷氨酸脱氢酶活性；2)慢性反应，如基因转录和调控β细胞新陈代谢。Hogg等[30]研究发现，在胎鼠胰岛中，氨基酸刺激IGF-Ⅰ的作用比葡萄糖更强烈；在动物早期生长中，氨基酸还可以通过调控合成代谢途径和脂肪沉积显著影响Ins分泌[31-32]。本试验中，与对照组相比，在配方奶粉中添加低聚糖类益生元显著提高SD大鼠血清中HDL-C的含量，并显著提高了血清中Arg、Ser和Ala的含量；在配方奶粉中添加多糖类益生元显著提高SD大鼠血清中Ins、IGF-Ⅰ和HDL-C的含量，显著提高血清中Arg、Ser、Gly、Ala和Tyr的含量。同时，本试验中，在配方奶粉中添加多糖类益生元显著降低了SD大鼠血清中UN的含量。这与前人研究的结果相一致，益生元调控血清中营养物质代谢的可能原因有：1)低聚糖和部分聚葡萄糖可以促进动物肠道内双歧杆菌增殖，而双歧杆菌通过影响胆固醇合成酶系中β-羟基-β-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶的活性来介导脂肪代谢[33]；2)机体对蛋白质利用率增加，同时血浆中一些与Ins和IGF-Ⅰ生成相关的氨基酸的含量升高，刺激Ins和IGF-Ⅰ分泌，进而加快机体脂肪沉积。

益生元同时可以降低癌症和心血管疾病等的发病率，有研究表明，高密度脂蛋白可以通过调控ATP结合蛋白A1和ATP结合蛋白G1参与反向转运胆固醇，降低巨噬细胞胆固醇含量，同时高密度脂蛋白还具有抗炎、抗氧化等维持机体健康的重要功能[34]，高密度脂蛋白代谢和血清TG含量相关，血清TG含量越高，高密度脂蛋白越容易降解[35]，本试验结果与此基本一致。益生元可能通过调控血清中CK活性来调控血压，研究发现，CK降低血压的可能途径如下：1)降低改变收缩蛋白局部ATP水平及肌球蛋白ATP酶活性；2)促进一氧化氮的生成；3)降低肾性水钠潴留能力[36-37]。

3.3 配方奶粉中添加益生元对SD大鼠养分表观消化率的影响

养分表观消化率的测定可以比较直观地反映饲粮的可消化性及动物的消化能力[38]。本试验结果显示，与对照组相比，在配方奶粉中添加多糖类益生元可以显著提高SD大鼠粗蛋白质和粗脂肪的表观消化率；在配方奶粉中添加低聚糖类益生元可以提高SD大鼠粗蛋白质和粗脂肪的表观消化率，但差异未达到显著水平。Kawasaki等[39]研究表明，在饲粮中添加低聚果糖对豚鼠氮的养分表观消化率无显著影响，但对氮的沉积有显著提高；陆翔等[40]研究表明，在配方奶粉中添加低聚果糖和低聚半乳糖可以提高SD大鼠蛋白质利用率；Martinelli等[41]研究发现，在布丁中添加一定量的乳清蛋白和聚葡萄糖可以降低健康成年人的食欲和饥饿感；Ibarra等[42]研究发现，在早餐饮食中加入聚葡萄糖可以降低Ins的分泌，而在中餐饮食中添加聚葡萄糖可以降低饥饿感，可能原因是聚葡萄糖提高了机体对养分的消化利用率；同时，权美平等[43]报道膳食纤维可以促进肠道消化吸收。上述试验结果与本试验结果基本一致。益生元可能通过促进肠道益生菌增殖来提高机体对养分的消化率，因益生菌可以分泌一种动物机体自身不能分泌的半乳糖苷酶，半乳糖苷酶可以提高粗蛋白质、粗脂肪和多糖等养分的消化吸收效率[44]。