麻黄-甘草药对治疗水肿机制研究

郝俊杰，李 杨

（成都中医药大学药学院，成都 611137）

甘草麻黄汤出自张仲景《金匮要略》，由甘草和麻黄两味药组成，主治“里水，一身面目黄肿”。麻黄和甘草配伍具有利水消肿的功效，在麻黄汤、葛根汤、越婢汤、麻杏石甘汤等中医名方中广泛使用。麻黄-甘草在临床使用过程中逐渐形成常用的相对固定的配伍形式，即“药对”〔1-3〕。麻黄-甘草药对对水肿的治疗作用及其相关的利尿作用已有文献报道，但其药效成分和疗效机制尚待进一步研究。

中药治疗疾病是多成分、多途径、多靶点、协同作用的结果，采用系统生物学等技术方法可以全面、准确把握中药治疗疾病的整体特征。2007年Hopkins等提出了“网络药理学”的概念，通过分析药物对疾病网络的干预，构建“药物-靶点-疾病”的作用网络，为药物研发及中药作用分析提供了新的策略〔4-5〕。网络药理学来预测中药配伍作用机制具有天然的优势，近年来利用网络药理学技术对中药及其配伍的作用机制进行了大量的预测研究〔6-7〕。因此，本研究运用网络药理学研究方法构建麻黄-甘草药对治疗水肿的“疾病-基因-药物”网络，并预测其分子机制，揭示其治疗水肿的作用靶点和生物学信号通路，为后续的分子生物学验证找到切入点，为药物开发和临床拓展应用提供依据。

1 方法

1.1 药物靶蛋白和疾病基因的查找 通过中药台湾数据库（TDT，http：∕∕tcm.cmu.edu.tw∕）和中药系统药理学分析平台TCMSP（http：∕∕lsp.nwu.edu.cn∕tcmsp.php）获得麻黄和甘草所含的化学成分和靶点信息。通过人类基因和基因表型综合数据库（OMIM，http：∕∕www.omim.org∕）筛选水肿相关的基因，使用Uniprot（https：∕∕www.uniprot.org∕）数据库转化为蛋白格式，建立水肿靶点数据集。人类的靶点连接蛋白通过交互蛋白数据库（http：∕∕dip.doe-mbi.ucla.edu）获得。为了便于统一分析，以上所有靶点均转化成UniProt ID（蛋白编号ID）格式〔8〕。

1.2 网络的构建及分析 先通过PPI（http：∕∕www.genome.jp∕kegg∕）分析，寻找麻黄和甘草的化学成分对应靶点和水肿的疾病靶点的交互蛋白。然后利用Cytoscape 3.6.1软件将麻黄和甘草的化学成分、成分对应的靶点、水肿对应的靶点和交互蛋白对应的靶点连接成“化学成分-靶点-疾病”网络并进行网络分析。将以上网络进行可视化分析，并将每个点的度、接近中心度等拓扑参数进行评估，筛选麻黄-甘草药对治疗水肿的目的靶点。

1.3 网络的构建 对“1.2”项筛选出的靶点使用STRING（https：∕∕string-db.org∕）进行蛋白互作关系分析，最后对筛选的靶点使用DAVID（https：∕∕david.ncifcrf.gov∕）数据库进行KEGG通路分析和使用Cytoscape软件的Blue GO插件进行基因功能分析。

2 结果

2.1 “药物-靶点-疾病”之间交互网络的构建 基于数据库构建方法，共筛选出麻黄中223个化学成分和370个靶点蛋白；甘草中27个化学成分和135个靶点蛋白。网络药理学预测出麻黄-甘草药对治疗水肿的交互网络，采用不同的形状图形使其可视化后，让我们更清晰直观地看出化合物与疾病靶点之间的网络关系。其中方形代表药物与疾病共同作用的靶点，也是麻黄-甘草药对治疗水肿最重要的靶点蛋白；圆点代表药物与疾病潜在的交互作用靶点；三角形代表麻黄-甘草药对中被预测出的活性化合物。见图1。

图1 麻黄-甘草药对治疗水肿的“化学成分-靶点-疾病”交互网络

2.2 麻黄-甘草药对治疗水肿作用筛选和相互作用分析 通过对Cytoscape交互网络分析，得出在麻黄-甘草药对活性成分关联水肿的40个蛋白靶点。对这些蛋白靶点进行拓扑参数计算。选择度大于中位数值2倍，介度中心度和接近中心度大于中位数值的靶点共同作为麻黄-甘草药对治疗水肿的重要靶点蛋白，3个拓扑参数中位数分别为：4.000 00、0.002 87和0.268 03。通过筛选得到10个麻黄-甘草药对治疗水肿的靶点。见表1。筛选出的靶点的蛋白互作关系见图2，蛋白相互作用关系表明筛选出麻黄-甘草药对治疗水肿的作用蛋白是相互关联和彼此调节的。把麻黄-甘草药对治疗水肿的靶点相关的化学成分进行提取。见图3和表2～3。

图2 麻黄-甘草药对治疗水肿的蛋白靶点互作关系图

图3 麻黄-甘草药对治疗水肿的靶点和相关的化学成分

表1 麻黄-甘草药对治疗水肿筛选的靶点蛋白信息

表2 甘草治疗水肿的靶点的相关化学成分信息

2.3 麻黄-甘草药对治疗水肿的GO功能（基因功能）分析 通过基因分析发现麻黄-甘草药对治疗水肿主要通过以下的生物学功能：血管内皮细胞迁移的调控（regulation of blood vessel endothelial cell migration）和单核细胞分化（monocyte differentiation）。见图4。

2.4 麻黄-甘草药对治疗水肿的KEGG通路分析对“2.2”项中筛选出的靶点在KEGG通路富集分析中，筛选出15条麻黄-甘草药对治疗水肿的通路。主要包括血管内皮生长因子信号通路（VEGF signaling pathway）、B细胞受体信号通路（B cell receptor signaling pathway）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、T细胞受体信号通路（B cell receptor signaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）、神经营养素信号通路（Neurotrophin signaling pathway）、Ras信号通路（Ras signaling pathway）等。见表4。

表3 麻黄治疗水肿的靶点的相关化学成分信息

表4 麻黄-甘草药对治疗水肿KEGG通路信息

3 讨论

本研究通过网络药理学分析构建了麻黄-甘草药对的“化学成分-靶点-疾病”交互网络图，筛选出麻黄-甘草药对治疗水肿的靶点蛋白并进一步分析其机制。在筛选出的蛋白中，核转录因子（Inhibitor of nuclear factor）〔9〕、血管内皮生长因子（Vascularendothelial growth）〔10〕、血清白蛋白（Serum albumin）〔11〕、过氧化物酶体增生物激活受体γ（proliferator-activated receptor gamma）〔12〕和前列腺素（Prostaglandin G∕H synthase 2）〔13〕都与水肿密切相关。通过分析发现血管内皮生长因子信号通路和基因功能分析得到的血管内皮细胞迁移的调控在麻黄-甘草药对治疗水肿中发挥着极其重要的作用。血管内皮生长因子调控内皮细胞迁移行为〔14〕，据报道血管内皮生长因子可通过影响内皮紧密结合蛋白的功能增加血管通透性，造成毛细血管渗漏，抗血管内皮生长因子药物可以治疗水肿〔15〕，因此麻黄-甘草药对可通过调节血管内皮生长因子信号通路来治疗水肿。其他信号通路如PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）、Ras信号通路（Ras signaling pathway）、MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）等均有报道在水肿中发挥了重要作用〔16-19〕。综上所述，采用网络药理学方法探索麻黄-甘草药对治疗水肿的作用机制，能够找到与疗效相关的生物信号通路。为下一步麻黄-甘草药对治疗水肿的分子生物学验证奠定了基础，本研究揭示了麻黄-甘草药对在治疗水肿方面的多维调控作用，为药物开发及临床应用奠定基础。