光谱法及分子模拟研究青蒿素与小牛胸腺DNA的相互作用

金丽虹 ， 王梦欣, 周雅静, 朱海焕, 刘美慧, 张善凯, 顾锡辉, 申炳俊*

(1. 长春理工大学 生命科学技术学院， 吉林 长春 130022； 2. 河南科技学院新科学院 生物与化学工程系， 河南 新乡 453003)

1 引 言

青蒿素(Artemisinin,简称QHS)是一种具有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，为植物黄花蒿(A.annuaL.)抗疟的有效成分。20世纪70年代，中国科学家首次分离得到青蒿素并解析了其化学结构，作为最有效的抗疟药物青蒿素受到了全世界高度关注[1-2]。随着青蒿素研究的不断深入，人们发现，除了具有抗疟活性外，青蒿素还在抗血吸虫[3]、抗内毒素[4]、抗变态反应[5]、抗红斑狼疮[6]、增强机体免疫[7]等方面也有药理作用。同时，青蒿素在治疗肿瘤和艾滋病方面展现出了诱人的应用前景[8-9]。2015年，屠呦呦研究员因发现青蒿素而获得诺贝尔生理学或医学奖[10]，这使得有关青蒿素的研究再次成为热点。全世界的学者们发表了大量与青蒿素有关的研究论文，其内容涉及疟原虫抗药性、抗疟和抗癌作用机制、作用靶点理论、生物活性及代谢调控等。然而令人遗憾的是，青蒿素抗疟和抗癌的具体分子机制至今尚未完全阐明。

DNA是所有生命活动的基础，也是一些药物最主要的作用靶点。药物小分子与DNA的相互作用能不同程度影响DNA的生理和物理化学性质，改变DNA的转录和复制，进而表现出抗病毒、抗肿瘤活性[11]。小分子物质与DNA的相互作用主要有3种模式：沟槽作用、嵌入作用和静电作用，其中具有选择性的沟槽和嵌插作用是药物分子和DNA相互作用研究的重点[12-13]。因此，在分子水平研究药物与DNA的相互作用机理，这对于了解药物药理活性、毒性以及预测药物相互作用等方面具有重要意义。已有文献表明，青蒿素可以嵌插到DNA分子中，两者间能形成QHS-DNA复合物[14]。但青蒿素嵌插到DNA的位置、非共价作用方式以及热力学参数等信息仍需要进一步研究。

基于此，本文采用吸收光谱、荧光光谱、共振散射光谱以及分子模拟等技术研究了青蒿素与DNA的相互作用模式、结合距离、分子间作用力、最佳作用位点等信息。实验结果为进一步揭示青蒿素抗疟、抗癌作用机理提供了依据。

2 实 验

2.1 材料与仪器

小牛胸腺DNA购买于Sigma公司，用pH 7.4的Tris-HCl缓冲溶液配成ctDNA储备液。青蒿素购买于成都普菲德公司，贮液用无水乙醇溶解配成。溴化乙锭(EB)购买于Sigma公司，用二次蒸馏水溶解配成储备液。上述储备液均置于4 ℃冰箱中保存。

测试仪器包括:UV-2550紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)，F-280荧光分光光度计(中国天津港东公司)，DELTA320型pH计(瑞士Mettler Toledo公司)，DC-4006高精度恒温水浴(上海菁海仪器公司)。

2.2 实验方法

2.2.1 紫外吸收光谱

于7 mL比色管中依次加入1 mL的Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4)、200 μL 4.5×10-4mol/L DNA储备液和不同体积的1.0×10-4mol/L青蒿素溶液，Tris-HCl缓冲溶液定容至4 mL，充分混合后于室温下作用30 min。以相应浓度的青蒿素Tris-HCl溶液为参比，扫描205～345 nm范围内QHS-DNA体系吸收光谱。Tris-HCl缓冲液作为参比，获得2.0×10-5mol/L 青蒿素Tris-HCl溶液吸收光谱。

2.2.2 荧光光谱

7个比色管中均加入1 mL Tris-HCl缓冲溶液、100 μL 4.5×10-4mol/L DNA储备液和180 μL 3.0×10-5mol/L EB溶液，充分混合于恒温水浴(298，304 K)中作用30 min。然后向每个EB-DNA体系中，依次加入不同体积青蒿素溶液，Tris-HCl缓冲溶液定容至3 mL，充分混合在恒温水浴中继续作用30 min，获得EB-DNA-QHS三元体系。扫描荧光发射光谱，激发波长(λx)488 nm，发射波长范围550～700 nm，激发(Ex)/发射狭缝(Em)为10 nm/5 nm。

2.2.3 共振散射光谱

依次将1 mL Tris-HCl缓冲溶液、280 μL 4.5×10-4mol/L DNA储备液和一定量1.0×10-4mol/L青蒿素溶液加入到7 mL比色管中，Tris-HCl缓冲溶液定容至3 mL，充分混合后在室温下作用30 min。λem=λex进行同步扫描，得到共振散射光谱，激发/发射波长均为200～700 nm，狭缝设定同前。

2.2.4 分子对接模拟

由Auto Dock Tools软件平台进行分子对接计算。首先在小分子数据库(Zinc)中获得小分子青蒿素晶体结构(ZINC ID:452191)。由蛋白质数据库(Protein data bank，PDB)中获取小牛胸腺 DNA 晶体结构(PDB ID:1BNA)，利用 Auto Dock4对其进行去水、加氢、加电荷等一系列初步处理。分子对接位点的活性区域包含整个DNA分子，活性区域大小为40 nm×40 nm×16 nm，格点步长为16 nm。使用拉马克遗传算法(LGA)对可能的构象和结合位点进行充分搜索，以结合能量最低的结构作为相互作用的最优模式。

3 结果与讨论

3.1 紫外吸收光谱法研究青蒿素与DNA的相互作用

3.1.1 青蒿素对DNA紫外吸收光谱的影响

青蒿素与DNA作用的紫外吸收光谱如图1所示。由图可知，青蒿素在220 nm区域显示出了较弱的吸收峰带，这是由于青蒿素氧上的孤对电子与双键之间发生了n→π*电子跃迁(见曲线1)。而DNA在258 nm的吸收峰源于碱基共轭双键结构(见曲线2)。与青蒿素作用后，DNA特征吸收峰出现减色效应，但最大吸收波长无明显偏移现象(见曲线3～5)。一般认为，小分子化合物与DNA相互作用后，若吸收光谱发生减少、红移，则表明小分子化合物是以嵌插方式与DNA结合，减色率大小及红移程度能初步反映小分子化合物与DNA相互作用的强弱；而小分子化合物若以静电作用与DNA结合，则峰位不发生改变，但有强度变化[12,15]。由此推断，青蒿素与DNA的结合模式可能为静电或分子部分结构发生嵌插作用。

1:cQHS=2.0×10-5 mol/L; 2～5: cDNA=2.25×10-5 mol/L, cQHS=(0, 2.0, 6.0, 10.0)×10-6 mol/L.

3.1.2 青蒿素对DNA熔点的影响

小分子化合物以嵌插模式与DNA结合时，能增加双螺旋结构稳定性，DNA熔点(Tm)可提高5～8 ℃，而非嵌入式结合一般对DNA的Tm影响不大[16]。将DNA和DNA-QHS溶液分别放置于20～95 ℃环境中，10 min后迅速取出并测量A258 nm。根据fss=ΔA′/ΔA=(A-A0)/(Af-A0)(A为表观吸光度，A0为起始吸光度，Af为最终吸光度)[17]，获得fss关于T的曲线，熔解曲线fss= 0.5处所对应的温度即为Tm，结果如图2所示。可以看出，DNA与青蒿素作用前后Tm分别为77 ℃和82 ℃，即Tm增加了5.0 ℃。因此，青蒿素与DNA发生了嵌插作用，该作用增加了DNA双螺旋结构稳定性。这与文献[14]结果一致。

cDNA=3.7×10-5 mol/L, cQHS =9.0×10-5 mol/L.

3.2 荧光光谱法研究青蒿素与DNA的相互作用

DNA虽无内源性荧光，但可以通过荧光探针法研究其与青蒿素的相互作用。溴化乙锭(EB)是一种典型的DNA嵌入试剂，本身荧光强度不大，当嵌入到DNA碱基对间时，其荧光强度显著地增大，所以，EB被广泛应用于筛选抗肿瘤药物以及小分子与DNA间相互作用的研究[12,18]。不同浓度的青蒿素对EB-DNA体系的荧光猝灭光谱如图3所示。可以看出，浓度逐渐增加的青蒿素引起了EB-DNA体系601 nm处荧光强度显著降低，峰位略红移(3 nm)。造成荧光猝灭的原因有以下两种可能：(1)青蒿素、EB与DNA的结合位点相同，两者竞争结合导致嵌插进DNA中的部分EB被置换出来；(2)青蒿素、EB与DNA结合位点不同，青蒿素嵌插进DNA碱基对，引起DNA构象改变及EB被挤出。无论是以上哪种原因，青蒿素均以嵌入方式与DNA发生结合，所生成QHS-DNA二元体系具有低荧光强度的特点，这与紫外吸收光谱和熔点实验结论是一致的。

cDNA =1.5×10-5 mol/L, cEB =1.8×10-6 mol/L, 1～7: cQHS=(0, 1.0, 3.0, 5.0, 7.0, 9.0, 11.0)×10-6 mol/L.

3.2.1 荧光猝灭方式

为探讨青蒿素对DNA-EB的荧光猝灭机制，采用Stern-Volmer方程[19-20]F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]处理数据。以F0/F对[Q]作图，Stern-Volmer拟合，由直线斜率可获得青蒿素对DNA-EB体系的猝灭常数Kq和Ksv值。由表1可知，Ksv值随温度的升高而降低，且Kq的数量级为1012，大于2×1010L/(mol·s)[12](最大碰撞速率常数)，说明青蒿素对EB-DNA荧光强度的猝灭类型为静态猝灭。

由Lineweacer-Burk双对数方程 (lg[(F0-F)/F]=lgKa+nlg[Q])[12]求得青蒿素与EB-DNA的结合常数Ka和结合位点数n。具体为：T=298 K时，Ka、n为1.43×103L/mol和0.76；T=304 K时，Ka、n为0.99×103L/mol和0.74。结合常数随温度的升高而降低，说明温度是影响结合能力的有力因素。而Ka数量级在102～103，低于经典DNA嵌插剂EB的结合常数(Ka= 1.4×106L/mol)[21]。这进一步证明青蒿素虽然以嵌插方式与DNA结合，但青蒿素分子仅有部分结构嵌入到DNA碱基对中，其嵌插能力弱于EB。

表1 不同温度下青蒿素对DNA-EB的猝灭参数

3.2.2 热力学参数及非共价键类型

小分子与生物大分子间的主要结合力可以通过热力学参数(ΔH、ΔS和ΔG)大小和符号进行判断。当实验体系温度变化很小时，焓变可被视为常数，其热力学参数可由Van’t Hoff方程[20]ln(KA2/KA1)=(1/T1- 1/T2)×ΔH/R和ΔG=-RTlnKa=ΔH-TΔS计算获得。青蒿素与EB-DNA体系反应的热力学参数结果见表2。根据Ross[22]的结果，ΔH<0、ΔS<0是范德华力和氢键的特征，由此可以判断，青蒿素与DNA间的相互作用力主要是范德华力和氢键。ΔG、ΔH为负值，表明该体系的结合为自发、放热过程。

表2 青蒿素与EB-DNA热力学参数

3.3 共振散射光谱法研究青蒿素与DNA的相互作用

青蒿素、青蒿素与DNA反应体系的共振散射光谱(RLS)分别见图4(a)、(b)。可以看出，青蒿素自身在372.1～400.0 nm范围有RLS信号，两个尖锐峰位于450 nm和467 nm处，RLS强度随着青蒿素浓度的增加而增大。依据文献[12, 17]研究表明，RLS强度与散射粒子的浓度成正比，因此RLS信号出现增强。与青蒿素相比，DNA溶液的RLS信号比较弱小(见图4(b)中曲线5)，当与青蒿素反应后引起了RLS信号增强(见图4(b)中曲线1～4)，RLS强度随青蒿素浓度增加而增大，其中以467 nm处的增强效果最为显著，而且峰形发生了变化。这是由于青蒿素与DNA两者间发生作用形成了复合物，该复合物在467 nm处有较强的RLS信号。体系中青蒿素浓度增大，使其嵌入到DNA碱基中分子亦增加，进而引起QHS-DNA复合物分子体积增大，分子量增加。因此，随着青蒿素浓度的增加，QHS-DNA体系RLS信号强度增大。

(a)1～4: cQHS=(1.0, 2.0, 3.0, 4.0)×10-6 mol/L. (b)1～4: cQHS=(1.0, 2.0, 3.0, 4.0)×10-6 mol/L, cDNA=4.2×10-6 mol/L; 5: cDNA=4.2×10-6 mol/L.

3.4 分子对接法研究青蒿素与DNA的相互作用

(a)， (b): Molecular docking of QHS-dodecamer(1BNA) interaction. (c): Binding force and distance of QHS-DNA complex.

4 结 论

在模拟生理酸度(pH 7.4)条件下，运用紫外吸收光谱法、荧光光谱法和共振散射光谱并结合分子模拟手段，研究了青蒿素与小牛胸腺DNA的相互作用。结果显示，在熵驱动下，青蒿素吡喃环部分结构能自发地嵌插到DNA小沟区域GA碱基对间，青蒿素与DNA间形成了复合物，氢键和范德华力是两者间结合的主要非共价作用方式，其作用强度适中，过程为放热反应。研究结果对于理解青蒿素与DNA作用机理以及进一步揭示青蒿素抗疟、抗癌机制提供了理论基础。